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Hématologie
Système du plasminogène et son exploration
Cours d'hématologie
 


 

Introduction :

La coagulation construit le caillot, la fibrinolyse le dissout pour faciliter la reperméabilisation d’un vaisseau.

Un équilibre entre coagulation et fibrinolyse est nécessaire à l’hémostase physiologique.

Cette capacité de l’organisme à dissoudre un caillot ou des dépôts fibrineux est connue depuis plus de 100 ans (Dastre, 1893), mais les études entreprises sur les mécanismes biochimiques complexes sont plus récentes.

Elles ont identifié la réaction fondamentale du système fibrinolytique, qui est l’activation localisée du plasminogène en plasmine au niveau d’un thrombus hémostatique.

Le système fibrinolytique, de même que celui de la coagulation, fait intervenir des activateurs et des inhibiteurs.

Le système fibrinolytique intervient dans la dissolution de fibrine intraet extravasculaire.

Il joue un rôle également dans la réaction inflammatoire, la cicatrisation des plaies, la fonction phagocytaire des macrophages, l’ovulation, l’embryogenèse et même la carcinogenèse.

Les activateurs essentiels du plasminogène sont le t-PA ou activateur tissulaire du plasminogène, et l’urokinase (u-PA), elle-même dérivée d’une pro-urokinase.

Les travaux récents ont également montré le rôle de la plasmine dans l’activation des métalloprotéases qui sont impliquées dans la destruction de la matrice extracellulaire et de nombreux précurseurs de cytokines, et le rôle de nombreux récepteurs du plasminogène et de ses activateurs.

Ainsi, un récepteur de l’urokinase ou U-PAR joue un rôle important dans la migration cellulaire et le remodelage tissulaire.

Les deux inhibiteurs les plus importants sont le PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) et l’alpha2-antiplasmine.

Ils appartiennent à la grande famille des serpines (serine protease inhibitors).

Le facteur intervenant dans le système de la fibrinolyse le plus récemment découvert est le TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor) qui est activé par la thrombine au cours de la formation du caillot et le protège contre sa dissolution prématurée.

Un caractère très particulier du système du plasminogène est que la fibrine est elle-même suicidaire, puisqu’elle favorise sa propre destruction en catalysant la réaction entre le plasminogène et le t-PA aboutissant à la plasmine.

Une fibrinolyse excessive entraîne des hémorragies, tandis qu’une diminution de l’activité fibrinolytique favorise les thromboses.

Récemment encore, la connaissance du rôle du système fibrinolytique a fait de nouveaux progrès grâce à l’étude d’animaux génétiquement déficients, incapables de synthétiser un ou plusieurs éléments du système fibrinolytique.

La multiplicité des rôles de la plasmine, en dehors de ceux propres à la fibrinolyse, fait actuellement préférer le terme de système du plasminogène à celui du système fibrinolytique.

Principaux constituants du système du plasminogène :

Toutes les sérines protéases du système de coagulation et du système fibrinolytique existent sous forme d’une molécule inactive appelée zymogène constituée d’une seule chaîne moléculaire, à l’exception du t-PA, qui est actif dans sa forme monocaténaire.

Elles sont transformées en molécules actives par le clivage d’une ou plusieurs liaisons.

Il existe une homologie de structure entre les différentes sérines protéases par la présence de plusieurs domaines : le domaine en doigt de gant (finger domain ou F), un domaine ayant une homologie avec un facteur de croissance (epidermal growth factor ou EGF) et le domaine kringle (K), du nom d’une pâtisserie danoise de forme voisine de celle d’un croissant français.

Ces kringles existent également dans des molécules des facteurs de coagulation.

Ceux de la prothrombine, du plasminogène et du t-PA ont été purifiés et caractérisés. Un autre domaine appelé domaine en forme de pomme existe uniquement dans la kallikréine.

Le domaine protéasique (P) se trouve sur le côté C-terminal de la molécule, et contient le site actif qui est constitué des trois acides aminés : sérine, histidine et acide aspartique.

L’homologie de structure des sérines protéases a fait émettre l’hypothèse de leur origine à partir d’une molécule ancestrale commune.

A - PLASMINOGÈNE :

1- Structure :

Le plasminogène humain, précurseur de la plasmine, est une glycoprotéine constituée d’une seule chaîne peptidique comprenant 791 acides aminés, 24 ponts disulfures, et environ 2 % d’hydrates de carbone. Son poids moléculaire est voisin de 92 kDa.

La molécule comprend sept domaines structurels composés d’une chaîne peptidique appelée peptide de préactivation, correspondant aux acides aminés 1 à 77, puis cinq séquences homologues appelées kringles K1 à K5.

Chaque kringle est formé d’environ 80 acides aminés et comprend trois ponts disulfures intramoléculaires.

L’extrémité de la chaîne comporte le site responsable de l’activité protéolytique P, formé des acides aminés 562 à 791.

Les kringles confèrent au plasminogène sa capacité à se lier aux résidus lysine de la fibrine et de l’alpha2-antiplasmine ou d’autres glycoprotéines comme la tétranectine, la glycoprotéine riche en histidine, le collagène, le kininogène, la matrice extracellulaire, la thrombospondine, l’immunoglobuline (Ig)G et les récepteurs membranaires.

L’affinité et la spécificité des kringles sont différentes vis-à-vis de certains ligands.

De faibles concentrations d’acide e-aminocaproïque (EACA) ou de lysine diminuent considérablement la fixation du plasminogène aux protéines plasmatiques (en particulier la fibrine).

Cette propriété est utilisée pour la purification du plasminogène par chromatographie d’échange d’ions sur diéthylaminoéthylcellulose (DEAE cellulose) à pH légèrement acide, ou par chromatographie d’affinité dans laquelle la L-lysine est immobilisée sur une colonne de sépharose.

La forme native du plasminogène est le Glu-plasminogène, qui possède un acide glutamique à son extrémité N-terminale.

Il existe sous deux formes qui diffèrent par leur degré de glycosylation : une forme glycosylée au niveau de l’Asn289 et de la Thr346, et une forme glycosylée uniquement au niveau de la Thr346.

Chacune des deux formes est subdivisée en six isoformes différentes dont les points isoélectriques (pI) sont compris entre 6,1 et 6,6.

Toutes ces formes moléculaires existent dans le plasma d’un même individu.

En l’absence de fibrine, la première forme est activée plus facilement en plasmine que la deuxième, mais en présence de fibrine aucune différence d’activation n’a été mise en évidence.

Le plasminogène peut subir des modifications post-transcriptionnelles, comme la phosphorylation de la Ser578 et la glycosylation des Ser249 et 339.

Le plasminogène est synthétisé essentiellement par le foie, mais les polynucléaires éosinophiles, le rein et la cornée sont aussi capables de le synthétiser.

Chez un individu normal, sa concentration plasmatique est de l’ordre de 2 µM, soit environ 200 mg/L, et augmente au cours des états infectieux ou inflammatoires et pendant le dernier trimestre de grossesse.

Sa concentration plasmatique est deux fois plus faible chez le nouveau-né à terme, et beaucoup plus faible encore chez l’enfant prématuré. Une diminution est également observée dans les atteintes hépatiques et au cours des traitements thrombolytiques.

La demi-vie du plasminogène natif est de l’ordre de 50 heures, alors que celle de la forme dégradée n’est que de 20 heures.

2- Gène du plasminogène :

Le gène du plasminogène humain est localisé sur le bras long du chromosome 6 au niveau de la bande 6q26-q27, sur une longueur de 52,5 kb au voisinage des gènes de la lipoprotéine(a).

Il est organisé en 19 exons séparés par 18 introns.

Le premier exon code le peptide signal ; le peptide d’activation et chaque kringle sont déterminés par deux exons. Les six autres exons codent la partie protéasique de la molécule.

La grossesse et l’interleukine 6 induisent une augmentation de l’expression du gène du plasminogène.

Les souris déficitaires en gène de plasminogène (souris plg–/–) développent des dépôts fibrineux au niveau du foie, comme chez les souris ayant un double déficit en t-PA et en urokinase, et sont prédisposées à des thromboses sévères et des lésions thrombotiques au niveau du tractus gastro-intestinal, du foie, du poumon, du pancréas et dans d’autres tissus.

L’administration de plasminogène en bolus corrige ces anomalies et diminue partiellement ces dépôts de fibrine.

3- Dysplasminogénémie et déficience en plasminogène :

Au moins une douzaine de mutants du plasminogène a été décrite chez des patients souvent asymptomatiques, mais qui peuvent être facteurs de risque de thromboses récidivantes et/ou d’une conjonctivite ligneuse.

Ces mutants peuvent être du type I (taux d’antigène et d’activité réduits : déficience en plasminogène) ou de type II (taux d’antigène normal mais activité réduite : dysplasminogénémie).

Il est intéressant de noter qu’une conjonctive produit du plasminogène, alors qu’une conjonctivite ligneuse est caractérisée par un dépôt important de fibrine au niveau oculaire.

L’administration de plasminogène par voie intraveineuse chez les malades atteints de conjonctivite ligneuse améliore rapidement ces lésions.

4- Conformation Glu- et Lys-plasminogène :

Les acides x-aminocarboxyliques sont des agents antifibrinolytiques qui inhibent l’activité de la plasmine in vitro et in vivo par leurs liaisons aux sites de fixation de la lysine (LBS : lysine binding sites) de la plasmine ou du plasminogène.

Cependant, à faible concentration, ces composés n’inhibent pas l’activation du plasminogène mais, paradoxalement, augmentent la vitesse de cette activation.

En l’absence de l’acide EACA, le Glu-plasminogène a une configuration fermée par l’interaction de la Lys50 du peptide d’activation N-terminal avec les LBS des kringles.

En revanche, en présence de 5 mM d’EACA, cette interaction est rompue, la molécule prend une configuration plus ouverte et devient plus accessible aux activateurs.

Le clivage du peptide d’activation du Glu-plasminogène provoque des changements conformationnels identiques.

La demi-vie du Lys-plg est plus courte.

Ce dernier s’active plus facilement en plasmine et possède une plus forte affinité pour la fibrine que le Glu-plg.

5- Activation du plasminogène :

Les activateurs du plasminogène agissent par l’hydrolyse de la liaison peptidique Arg561-Val562 du plasminogène, pour donner naissance à une molécule de plasmine composée de deux chaînes.

La chaîne B de la Glu-plasmine reste attachée à la chaîne A par deux ponts disulfures.

L’activation du Glu-plg in vitro génère des traces de plasmine qui provoquent l’hydrolyse des liaisons Arg68-Met69, Lys77-Lys78 et Lys78-Val79 pour donner naissance à des formes dégradées de plasminogène comme le Lys78-plg, le Met69-plg et le Val79-plg.

Dans les conditions physiologiques, l’activation du plasminogène est contrôlée à différents niveaux, et la plasmine libre est très rapidement neutralisée par l’alpha2-antiplasmine.

Dans un plasma normal, l’utilisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre le Lysplg n’a révélé aucune présence de Lys-plg libre ni de Lys-plasmine.

Seules des traces de ces composés ont été mises en évidence chez les patients ayant reçu un traitement thrombolytique.

6- Propriétés de la plasmine :

Les propriétés de la plasmine sont similaires à celles de la trypsine.

Outre son rôle dans la fibrinolyse et la fibrinogénolyse, la plasmine agit sur d’autres protéines du système d’hémostase (comme les facteurs V, VIII, XIII activés, le facteur von Willebrand et les glycoprotéines plaquettaires), sur certaines fractions du complément, et peut activer des proformes de facteurs de croissance et de métalloprotéases en formes actives.

L’action de la plasmine sur le fibrinogène et sur la fibrine aboutit à un grand nombre de produits de dégradation dont la structure chimique a été établie.

La plasmine libre est rapidement neutralisée par l’alpha2-antiplasmine, et est éliminée de la circulation avec une demi-vie de 4,5 heures.

7- Liaison du plasminogène à la fibrine :

L’activation du plasminogène en plasmine est très limitée dans le temps et dans l’espace, car elle doit être localisée sur la fibrine formée et éviter une protéolyse généralisée qui peut attaquer d’autres protéines.

Le but principal du système du plasminogèneplasmine est non seulement de lyser le caillot formé, mais aussi de prévenir la formation excessive de fibrine.

Le Lys-plg a une affinité plus forte pour la fibrine native que le Gluplg.

Cette différence disparaît pour la fibrine dégradée, probablement par le changement de conformation du Glu-plg.

La séquence 148-160 sur la chaîne a de la fibrine a été identifiée comme le site principal de fixation du plasminogène sur la fibrine native polymérisée.

Or, une fois la lyse de la fibrine mise en route, de nouveaux résidus lysine C-terminaux sont générés sur la fibrine et fixent de nouvelles molécules de plasminogène, produisant ainsi une accélération de la lyse.

8- Angiostatine :

L’angiostatine est un fragment de 38 kDa issu de la protéolyse du plasminogène.

Elle est formée par les quatre premiers kringles (K1 à K4). Dans la plupart des cellules tumorales, on a identifié des protéases qui dégradent le plasminogène et génèrent de l’angiostatine.

L’élastase sécrétée par les macrophages et la stromélysine-1 peuvent générer des fragments similaires à ceux de l’angiostatine.

In vitro, l’angiostatine inhibe la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses, joue un rôle dans la prévention de l’athérosclérose, et induit l’apoptose de cellules endothéliales en culture.

B - ACTIVATEURS PHYSIOLOGIQUES DU PLASMINOGÈNE :

1- Urokinase et pro-urokinase :

L’urokinase urinaire est produite par les cellules rénales et excrétée dans l’urine.

Des études en immunohistochimie ont montré la présence d’urokinase dans les fibroblastes du tissu conjonctif, dans les cellules épithéliales et dans les monocytes-macrophages.

Sous l’effet des endotoxines ou du TNF (tumor necrosis factor), les cellules endothéliales en culture sont capables de produire de l’urokinase.

In vivo, sa synthèse a été démontrée au niveau de l’endothélium vasculaire.

L’urokinase a été préparée également par génie génétique.

La fonction principale de l’urokinase est exercée au niveau des tissus, dans les processus de migration cellulaire, du remodelage tissulaire, de dégradation de la matrice extracellulaire, de l’invasion tumorale et de la formation de métastases.

* Différentes formes de l’urokinase :

La pro-urokinase ou scu-PA (single chain urinary-type plasminogen activator) est une protéine de 55 kDa.

Elle est constituée d’une seule chaîne de 411 acides aminés dont 24 sont des cystéines formant 11 ponts disulfures.

Sa concentration plasmatique est de l’ordre de 2 à 4 ng/mL.

Sa demi-vie de 7 minutes environ est comparable à celle de l’activateur de plasminogène de type tissulaire (t-PA).

Son catabolisme est assuré par le foie.

Le domaine EGF interagit avec les récepteurs cellulaires de l’urokinase, et intervient dans la mitogenèse et la différenciation cellulaire.

Le kringle n’a pas d’affinité pour la fibrine, son rôle est encore mal connu.

Il est lié par un peptide relativement long au domaine protéolytique P.

Le domaine C-terminal est formé de 252 acides aminés et contient le site actif qui comprend les acides aminés His204, Asp255, et Ser356.

La scu-PA ne réagit pas avec les inhibiteurs des protéases, mais elle reste stable dans le plasma et conserve son potentiel fibrinolytique.

Différentes enzymes, dont la plasmine et la kallikréine, peuvent scinder la pro-urokinase au niveau de la liaison Lys158-Ile159, donnant naissance à deux formes d’urokinase :

– une urokinase de haut poids moléculaire.

Formée d’une chaîne lourde de 30 à 33 kDa contenant le site actif lié par un pont disulfure à une chaîne légère de 20 à 22 kDa, cette forme à deux chaînes est appelée tcu-PA (two chain urinary-type plasminogen activator) ;

– une urokinase de bas PM. C’est la forme dégradée de l’urokinase de haut PM ayant conservé sa chaîne lourde et un fragment de 2,4 kDa de la chaîne légère.

Ces deux formes sont rapidement inactivées par le PAI-1, avec une demi-vie d’inactivation de l’ordre de 4 à 7 minutes.

* Gène de l’urokinase :

Le gène humain de l’urokinase est situé sur le chromosome 10 au niveau de la bande q24, sur une longueur de 6,4 kb.

Il est constitué de 11 exons.

Dans la région flanquante en 5’ du gène de la scu-PA se trouvent plusieurs éléments cis-régulateurs qui interagissent avec des facteurs de transcription, et modulent ainsi l’expression de la scu-PA.

Parmi ces éléments cis-régulateurs, on a identifié des motifs d’acide désoxyribonucléique (ADN) qui lient les facteurs de transcription AP1, CREB/ATF, Ets, GR, NF-jB et autres.

À une distance de 2 kb, en amont du site d’initiation de la transcription, se trouve une région stimulatrice de transcription (enhancers).

Une description détaillée de ces éléments cis- et transrégulateurs et une bibliographie étendue ont été publiées.

* Études génétiques chez la souris :

L’équipe de Carmeliet a étudié des souris génétiquement déficientes en facteurs du système fibrinolytique.

Il n’existe pas de déficit homozygote connu du t-PA ou d’u-PA chez l’homme, et curieusement, cette malformation a été considérée comme potentiellement létale.

Les souris déficientes en gène de l’u-PA (u- PA–/–), développent des dépôts mineurs de fibrine dans le foie et les intestins, et des dépôts importants dans des ulcérations chroniques non cicatrisantes de la peau sans formation spontanée de thrombi vasculaires.

La cicatrisation des plaies et le système immunitaire sont détériorés.

La lyse d’un caillot de fibrine marqué à l’iode 125, injecté dans la veine jugulaire et embolisé dans l’artère pulmonaire, est comparable à celle des souris sauvages.

* Propriétés pharmacologiques :

L’urokinase, quelle que soit sa forme moléculaire, provoque le clivage de la liaison Arg561-Val562 du plasminogène, et le transforme en une molécule de plasmine formée de deux chaînes liées par deux ponts disulfures.

Le Glu-plg est plus facilement activé par l’urokinase de haut PM que par l’urokinase de bas PM.

La Glu-plasmine formée peut, par action protéolytique, agir sur une deuxième molécule de Glu-plg, et conduire au Lys78-Plg par l’hydrolyse d’une liaison située sur la partie N-terminale.

Contrairement à la tcu-PA, la scu-PA a une certaine spécificité pour la fibrine, car elle provoque une faible protéolyse du fibrinogène, du plasminogène et de l’alpha2-antiplasmine, qui sont mieux préservés.

Le t-PA et la scu-PA agissent par des mécanismes différents et complémentaires.

Au fur et à mesure que la fibrine se dégrade, de nouveaux résidus lysine C-terminaux sont générés sur la chaîne a et augmentent la vitesse de fixation du Glu-plg sur la fibrine.

La scu-PA a une forte affinité pour le plasminogène (Kd = 65 nM) et active sélectivement le Glu-plg lié à la fibrine partiellement dégradée.

Collen et ses collaborateurs ont étudié les effets thrombolytiques du t-PA et de la scu-PA sur un modèle de thrombose de la veine jugulaire de lapin.

Ils ont conclu qu’une thrombolyse par du t-PA suivie par une administration de scu-PA, est plus efficace qu’une thrombolyse par la scu-PA suivie de t-PA.

Au cours de la coagulation, la kallikréine générée par l’activation du système contact transforme la scu-PA en tcu-PA.

Ce processus peut avoir lieu en l’absence de plasminogène.

Dans les conditions physiologiques ou pathologiques, et contrairement au t-PA et au PAI-1, la concentration plasmatique circadienne de l’u-PA reste stable.

* Récepteurs de l’urokinase (u-PAR) :

L’activité catalytique de la scu-PA est augmentée d’environ 100 fois quand elle est liée à son récepteur membranaire des monocytes et des autres cellules, ce qui accélère fortement la lyse d’un thrombus.

L’u-PAR est un polypeptide de 55 kDa, constitué de 313 acides aminés.

Le gène de l’u-PAR est situé sur le chromosome 19, sur une longueur de 23 kb.

Il est formé de sept exons et de six introns.

Son expression est induite par plusieurs facteurs comme des promoteurs tumoraux, des facteurs de croissance, des cytokines et des hormones.

L’u-PAR est attaché aux phospholipides membranaires par un glycosyl phosphatidyl inositol (GPI) qui peut être hydrolysé par une phospholipase C (PLC) spécifique du phosphatidyl inositol.

Son extrémité N-terminale est formée d’un domaine de fixation de l’urokinase, et de deux autres domaines qui facilitent cette fixation.

L’u-PA fixée à l’u-PAR (et convertie en tcu-PA) est accessible à l’inactivation par le PAI-1.

Le complexe ternaire tcu-PA/u- PAR/PAI-1 est internalisé, et l’u-PAR est recyclé sur la surface cellulaire.

Ce processus exige la présence d’un autre récepteur appelé LRP (lipoprotein related protein).

À l’origine, on pensait que l’u-PAR jouait les seules fonctions de localiser et d’augmenter l’activation du plasminogène par l’u-PA à la surface cellulaire, mais d’autres activités ont été mises en évidence.

L’u-PAR activé par l’u-PA interagit avec la vitronectine et la b1-intégrine, déclenchant l’adhésion cellulaire et la transduction de signaux intracellulaires, et active le récepteur chimiotactique FPRL1/LXA4R, établissant ainsi une relation entre système fibrinolytique et inflammation.

Il existe d’autres récepteurs de l’u-PA qui interviennent soit dans la stimulation de l’activation du plasminogène, soit dans l’élimination des complexes u-PA/serpines circulants.

Ces derniers sont le récepteur de l’asialoglycoprotéine, localisé principalement dans les cellules hépatiques, et le récepteur des lipoprotéines de très faible densité ou VLDL (very low density lipoproteins).

2- Activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) :

Le t-PA est une sérine protéase de 68 kDa, présent dans le plasma humain à la concentration de 5 µg/L.

Il est en grande partie complexé au PAI-1.

Le t-PA libre exerce son effet en premier lieu dans le système vasculaire par la dissolution des thrombi en activant le plasminogène lié au caillot.

Il est synthétisé principalement par les cellules endothéliales, et également produit par d’autres cellules comme les macrophages-monocytes, les mégacaryocytes, les cellules mésothéliales, les mastocytes, les fibroblastes cardiaques et les neurones.

De réels progrès dans l’extraction du t-PA ont été réalisés, après sa découverte en grande quantité dans une lignée cellulaire du mélanome humain.

Le t-PA recombinant utilisé en thérapie thrombolytique est produit par génie génétique.

* Structure du t-PA :

La protéine mature existe sous deux formes moléculaires : une forme native monocaténaire ou sct-PA (single chain t-PA) composée de 527 acides aminés, et une forme bicaténaire ou tct-PA (two chain t-PA), obtenue après le clivage de la forme native par la plasmine au niveau de la liaison Arg275-Ile276.

Le sct-PA n’est pas un zymogène mais une protéase active.

La molécule de t-PA est formée de cinq domaines, dont quatre sont situés sur la chaîne A de 36 kDa :

– à l’extrémité NH2-terminale, se trouve une séquence de 38 acides aminés qui présente une homologie avec le domaine F de la fibronectine, et qui est responsable de sa fixation à la fibrine ;

– une séquence de 49 acides aminés qui présente une homologie avec l’EGF ;

– deux kringles homologues à ceux du kringle 4 du plasminogène et de l’urokinase, le kringle 2 se fixe également à la fibrine.

La chaîne B de 32 kDa comprend le domaine catalytique ou protéasique P qui comporte une séquence de 230 acides aminés.

Le site actif comprend l’His322, l’Asp371 et la Ser478. Il existe deux formes différentes de glycosylation.

Le type I est glycosylé en trois positions Asn117, Asn184 et Asn448 ; le type II, dont la masse moléculaire est inférieure à 3 kDa, est glycosylé seulement en deux positions Asn117 et Asn448.

Le type II a une affinité moindre pour la fibrine et une activité fibrinolytique plus faible que le type I.

* Gène du t-PA :

Le gène du t-PA est localisé sur le chromosome 8 au niveau de la bande p12-q11.2, sur une longueur de 32,7 kb.

Le peptide signal est constitué de 20 acides aminés.

Il existe une assez grande similitude dans l’organisation des gènes de t-PA et de l’u-PA.

Plus de 9 500 paires de bases ont été séquencées dans la région flanquante en 5’ du gène du t-PA.

Parmi les éléments cis-régulateurs qui interagissent avec les facteurs de transcription et modulent l’expression du t-PA, on a identifié trois boîtes TATA, une boîte CAAT, CREB, CTF/NF, trois Sp1, et trois boîtes GC/GT.

À une distance de 7 kb en amont du site d’initiation de la transcription, se trouve une région stimulatrice de transcription (enhancer) multihormone qui est activée par les glucocorticoïdes, la progestérone, les androgènes et les minéralocorticoïdes.

Des descriptions détaillées de ces éléments cis- et transrégulateurs ont été publiées.

* Anomalies génétiques :

Plusieurs polymorphismes génétiques ont été mis en évidence sur le gène du t-PA.

L’un d’entre eux, au niveau de l’intron h, est un polymorphisme d’insertion/délétion d’une séquence Alu.

Les résultats de trois études épidémiologiques sur l’association de ce polymorphisme avec le risque d’accident cardiovasculaire ont été contradictoires.

Aucune déficience congénitale de t-PA n’a été décrite dans la littérature.

Carmeliet et al ont démontré que la destruction du gène de t-PA ne provoque aucune anomalie macroscopique, et les souris se développent normalement.

Les études de lyse de caillots plasmatiques ont démontré une réduction de l’activité fibrinolytique par rapport à celle des souris sauvages.

La thrombogenèse induite par des endotoxines chez des souris t-PA–/–, ne provoque pas de lésions thrombotiques, mais de légères anomalies par rapport aux souris t-PA + / +.

Cependant, les souris avec une double déficience t-PA–/– et u-PA–/– souffrent de thromboses spontanées sévères et d’une réduction de la fertilité et de l’espérance de vie.

* Propriétés enzymatiques du t-PA :

Le t-PA agit sur le plasminogène par le clivage de la liaison Arg561- Val562.

Son activité est potentialisée à la surface de la fibrine par sa liaison au plasminogène. Le sct-PA se lie plus facilement à la fibrine que le tct-PA.

En l’absence de fibrine, le tct-PA est 3 à 10 fois plus actif que le sct-PA. Les inhibiteurs des protéases, et plus particulièrement le PAI-1, agissent d’une manière plus faible sur le sct-PA que sur le tct-PA.

En présence de fibrine, ces différences disparaissent. Deux observations expliquent ce phénomène.

Le sct-PA change de conformation après sa fixation à la fibrine, et le nombre de sites de faible affinité sur la fibrine est considérablement plus élevé pour le tct-PA.

En présence de plasminogène, l’affinité du t-PA pour la fibrine est augmentée de 20 fois environ (Kd = 20 nM) par rapport à celle obtenue en l’absence de plasminogène.

Cette potentialisation peut être expliquée soit par la formation d’un complexe ternaire formé de t-PA, de plasminogène et de fibrine, soit par une plus forte fixation du t-PA au plasminogène qui s’est fixé préalablement à la fibrine et a subi un changement de configuration.

Plusieurs auteurs ont trouvé une cinétique enzymatique non linéaire, plus particulièrement en présence de fibrine.

Ceci n’est pas dû à la conversion du sct-PA en tct-PA et/ou à la conversion du Glu-plg en Lys-plg.

Norrman et al ont conclu qu’en présence de fibrine, l’activation du Glu-Plg par le t-PA comprend une phase initiale (km = 1,05 µM) et une finale (km = 0,07 µM).

Cette dernière phase peut être expliquée par la génération de nouveaux résidus lysine au niveau de l’extrémité C-terminale de la fibrine partiellement dégradée, résidus qui possèdent une forte affinité pour le t-PA et le plasminogène.

Sur la fibrine, trois sites spécifiques augmentent la vitesse d’activation du plasminogène.

Le premier site, appelé FCB-2, se trouve sur un fragment produit par le clivage de la molécule par du bromure de cyanogène, et contient la séquence Aa 148-160.

Le deuxième site se trouve dans la séquence Aa 392-610 et le troisième, appelé FCB-5, correspond à deux fragments c 311-336 et c337-379 qui sont liés par un pont disulfure.

Les trois séquences sont dissimulées dans la molécule de fibrinogène, et s’exposent pendant sa conversion en fibrine.

Les fragments Aa 148-160 et Aa 392-610 fixent le plasminogène et le t-PA, alors que le fragment c 311-379 ne fixe que le t-PA.

Une étude récente a montré que le t-PA est capable d’activer le FVII, et peut ainsi exercer une activité procoagulante.

* Propriétés non enzymatiques :

Le t-PA exerce un effet anti-inflammatoire et stimule la prolifération des cellules endothéliales.

L’aprotinine est sans effet sur ces mécanismes, qui sont indépendants de l’activité protéolytique du t-PA.

* Régulation :

Le t-PA stocké dans des vésicules spécialisées des cellules endothéliales et neuroendocrines est libéré par deux voies : une voie constitutive et une voie régulée.

En ce qui concerne la voie constitutive, les concentrations du t-PA varient énormément au cours des 24 heures.

L’activité du t-PA est faible au cours de la nuit et tôt le matin, puis elle augmente de trois fois environ pendant la journée.

Une stimulation prolongée et modérée de l’activité fibrinolytique constitutive est obtenue avec les stéroïdes anabolisants, et plus particulièrement le stanozolol.

Dans la voie régulée, le t-PA est libéré en quelques minutes sous l’action d’une grande variété de stimuli extracellulaires, comme la bradykinine, l’histamine, l’acétylcholine, l’adrénaline, le PAF, l’endothéline et l’ionophore A23187.

Ces produits induisent un flux calcique à l’intérieur des cellules endothéliales, et activent une protéine G couplée aux récepteurs.

Parmis les agents bêta-adrénergiques, l’isoprotérenol augmente la concentration plasmatique de t-PA d’une manière dose-dépendante.

En revanche, la phényléphrine, un agent alpha-adrénergique, augmente le taux de t-PA par diminution du flux sanguin hépatique, entraînant une réduction de la clairance du t-PA.

L’exercice physique intense, le stress et l’anxiété provoquent une augmentation du t-PA par des stimulations alpha- et bêta-adrénergiques et de la vasopressine.

La vasopressine et son analogue, le DDAVP (1-désamino-8-D-arginine vasopressine) stimulent la libération de t-PA, probablement via le recepteur V2.

Au cours des années 1980 et 1990, le DDAVP a été utilisé dans l’évaluation du potentiel fibrinolytique induit par la libération de t-PA chez des patients ayant des thromboses veineuses profondes (TVP) idiopathiques.

L’effet de l’alcool sur le système fibrinolytique est controversé.

Certaines études ont démontré une stimulation de la synthèse de t-PA et de l’u-PA dans les cellules endothéliales humaines de la veine saphène, après une brève exposition (moins de 30 minutes) à l’alcool à faible concentration (inférieure à 0,1 %).

Une consommation accrue d’alcool augmente la libération de t-PA antigène, contrebalancée par une forte libération de PAI-1.

L’application d’une occlusion veineuse, à une pression intermédiaire entre la pression sanguine systolique et diastolique, provoque une sécrétion locale de t-PA.

La quantité de t-PA libérée après une occlusion veineuse au niveau de l’avant-bras est comprise entre 0,5 et 1,1 ng/mL.

Après une occlusion au niveau de la jambe, le t-PA libéré est 10 fois plus faible.

Cette sécrétion plus faible au niveau des extrémités inférieures est probablement due à la pression hydrostatique.

En effet, l’occlusion veineuse pendant 20 minutes chez des patients immobilisés provoque une forte libération de t-PA après une dizaine de jours de repos, par rapport à celle observée au début de l’immobilisation.

La plus faible production de t-PA au niveau du mollet contribuerait à l’incidence élevée des thromboses veineuses profondes (TVP) des membres inférieurs.

* Métabolisme :

Le t-PA libre ou complexé est éliminé rapidement de la circulation.

Il se lie à une variété de récepteurs membranaires des cellules endothéliales et des hépatocytes.

Chez un individu normal, la clairance du t-PA est très rapide (3,5 minutes) si le taux de PAI-1 est faible, et elle est plus lente (5,3 minutes) si le taux de PAI-1 est élevé.

Ceci peut être expliqué par une clairance plus lente du complexe t-PA/PAI-1, qui est de 5 minutes.

Dans les cirrhoses du foie, la clairance métabolique du t-PA est diminuée, ce qui augmente le taux de t-PA dans le plasma.

* Mutants du t-PA et leurs interactions avec les serpines :

Dans le plasma, le t-PA est en grande partie complexé au PAI-1 qui est légèrement en excès.

Le PAI-1 agit plus facilement sur le tct-PA que sur le sct-PA.

Le remplacement des trois arginines en positions 298, 299 et 304 par des alanines aboutit à un mutant qui est inhibé beaucoup moins rapidement par le PAI-1 que le t-PA natif.

Ces études ont permis d’obtenir de nouveaux mutants de t-PA, comme le ténectéplase (TNK-t-PA) dont les acides aminés Lys296-His297- Arg298-Arg299 sont remplacés par quatre alanines.

Il existe d’autres mutants du t-PA, tous éliminés moins rapidement que le t-PA natif : le rétéplase (rPA ; délétion des domaines en doigt et EGF), le lanotéplase (nPA, SUN 9216 ; délétion des domaines en doigt et EGF et substitution de l’Asn 117 par une Gln), le montéplase (E6010 ; substitution de la Cys84 par une Ser), et le pamitéplase (YM 866 ; délétion du kringle 1 et substitution de l’Arg275 par une Glu).

Tous ces mutants ont été utilisés dans des essais cliniques par injection en bolus, grâce à leur demi-vie beaucoup plus élevée que le t-PA natif.

* Récepteurs du t-PA :

Les récepteurs du t-PA peuvent êtres classés en deux groupes fonctionnels distincts ; un groupe qui intervient dans l’activation du plasminogène en plasmine, et un autre groupe qui intervient dans l’élimination du t-PA.

Le premier type de récepteurs localise le t-PA à la surface des cellules, et intervient dans l’activation du plasminogène en plasmine. Parmi ces récepteurs, on trouve l’annexine II de 42 kDa, l’actine de 45 kDa, l’héparane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cytokératine 8 et 18 et la tubuline.

Chez certains patients atteint de leucémie promyélocytaire, la plus forte expression d’annexine II est associée à un état hyperfibrinolytique.

Le deuxième groupe de récepteurs comprend le récepteur du mannose et la LRP (lipoprotein related protein)/récepteur de l’alpha2-macroglobuline.

+ Récepteur du mannose :

Chez l’animal, il a été démontré que la fixation du t-PA aux cellules hépatiques et aux cellules de Kupffer est inhibée par l’ovalbumine.

La vitesse d’élimination du mutant de t-PA déficient en Arg117 (qui est un site de glycosylation par le mannose) est faible.

Le t-PA a une plus forte affinité pour ce récepteur (kd = 1 à 4 nM) que les autres glycoprotéines comme la ribonucléase B, la bêta-glucuronidase et l’ovalbumine (kd = 60 à 600 nM).

L’administration d’estradiol à des souris provoque une forte expression du récepteur du mannose, et augmente la clairance du t-PA.

+ Récepteur LRP :

C’est une glycoprotéine de 600 kDa formée de 4 525 acides aminés.

Elle intervient dans la clairance de l’apoprotéine E, des toxines, des cytokines, des complexes alpha2-macroglobuline/protéases, de t-PA libre ou complexé au PAI-1, et du complexe u-PA/PAI-1.

Ce processus est inhibé par une protéine de 39 kDa appelée RAP (receptor associated protein).

Comparé au t-PA libre, le complexe t-PA/PAI-1 est éliminé au moins dix fois plus rapidement par le récepteur LRP.

La glycoprotéine 330 et le récepteur de 130 kDa des lipoprotéines de très faible densité (VLDL) sont aussi capables d’éliminer le t-PA libre ou complexé au PAI-1.

L’inhibition des récepteurs du mannose et de LRP diminue la clairance du t-PA de 10 fois environ.

3- Activation du plasminogène facteur XII-dépendante : interaction de la phase contact de la coagulation avec la fibrinolyse

L’activité fibrinolytique d’un plasma déficient en facteur XII, en prékallikréine (PK) et en kininogène de haut poids moléculaire (KHPM) est faible.

Inversement, l’addition de sulfate de Dextran ou de kaolin au plasma normal entraîne un raccourcissement du temps de lyse des euglobulines isolées à partir de ce plasma.

Au cours d’une lésion endothéliale, il est probable que la phase contact s’active localement par l’interaction du facteur XII avec le sousendothélium, générant du facteur XII activé (XIIa) qui est capable d’activer directement le plasminogène et la kallikréine qui peut convertir le scu-PA en tcu-PA.

La kallikréine et les facteurs XIa, XIIa et le fragment b du facteur XIIa sont à l’origine de l’activité fibrinolytique facteur XII-dépendante.

Le système est autocatalytique puisque la plasmine, comme la kallikréine, permet la transformation du facteur XII inactif en facteur XII activé.

4- Activation de la fibrinolyse d’origine leucocytaire :

Il existe également une activité fibrinolytique dans les éléments figurés du sang comme les leucocytes.

Ces protéases conduisent à des produits de dégradation du fibrinogène différents de ceux produits par la plasmine.

Les principales enzymes leucocytaires douées de cette activité fibrinolytique sont l’élastase et la cathepsine G, d’un poids moléculaire respectif de 28 et 30 kDa.

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