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Hématologie
Système du plasminogène et son exploration (Suite)
Cours d'hématologie
 


 

C - AUTRES AGENTS FIBRINOLYTIQUES :

1- Activateur de la chauve-souris (« vampire bat plasminogen activator ») :

Dans les années soixante, Hawkey a découvert une substance dans la salive de la chauve-souris Desmodus rotundus.

Cet hématophage sécrète une enzyme salivaire indispensable au maintien de la fluidité du sang ingéré.

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Cette enzyme appelée DSPA possède 70 % d’homologie de structure avec le t-PA humain.

Trois formes moléculaires ont été identifiées : la forme a possède un domaine en forme de doigt, un domaine EGF, un domaine kringle et un domaine protéasique ; la forme b ne possède pas de domaine kringle, et la forme c ne possède que les domaines kringles et le centre actif.

Le DSPA a une affinité plus forte pour la fibrine que le t-PA.

Des essais thérapeutiques sont en cours.

2- Streptokinase (SK) :

C’est une protéine bactérienne obtenue à partir de filtrats de cultures de streptocoque b-hémolytique, constituée d’une seule chaîne polypeptidique de 414 acides aminés, son PM est de 47 kDa.

La molécule de SK ne contient ni cystéine ni hydrate de carbone.

Son activité spécifique est de 100 000 UI/mg. La SK est immunogène et induit la formation d’anticorps.

Elle ne transforme pas directement le plasminogène en plasmine, mais forme avec le plasminogène humain un complexe SK.plg équimoléculaire.

Le complexe acquiert des propriétés enzymatiques liées à l’apparition, sur le plasminogène, d’un site actif qui est capable d’une part de se transformer en complexe actif SK.plasmine (SK. pli), d’autre part d’activer le plasminogène libre en plasmine par l’hydrolyse de la liaison Arg561-Val562.

Le complexe SK.pli est plus résistant à l’action inhibitrice de l’alpha2-AP que la plasmine seule.

Après une injection intraveineuse chez l’homme, la SK est éliminée avec une demi-vie de 15 à 30 minutes.

Les complexes SK.plg ou SK.pli réagissent avec l’alpha2-antiplasmine et l’alpha2-macroglobuline, et sont éliminés de la circulation par des récepteurs au niveau du foie.

Tout comme l’urokinase, la SK a très peu d’affinité pour la fibrine.

Les complexes SK.plg et SK.pli sont capables d’hydrolyser différents substrats synthétiques, ce qui permet leur dosage.

3- Acyl-enzymes (APSAC) :

Ce sont des complexes formés de plasminogène humain et de SK, qui sont inactivés au niveau du site catalytique par un groupement p-anisoyl.

Le Lys-plg est préféré au Glu-plg en raison de sa plus grande affinité pour la fibrine.

Il est commercialisé sous le nom d’éminase (p-anisoyl-SK-Lys-plasminogène ; anisoylated plasminogen-SK activator complex ou APSAC).

Grâce au plasminogène inclus dans le complexe, l’APSAC a une certaine affinité pour la fibrine qui devrait théoriquement favoriser son action in situ.

Une fois fixé sur le caillot, le complexe se déacyle progressivement, et acquiert la capacité d’activer le plasminogène « local » en plasmine.

L’APSAC provoque une fibrinogénolyse, et consomme le plasminogène et l’alpha2-antiplasmine.

Utilisé à des concentrations thérapeutiques, sa demi-vie est de 40 minutes environ.

4- Staphylokinase :

La staphylokinase (STA) est produite par certaines souches de Staphylococcus aureus.

Elle est connue depuis plus de quatre décennies pour avoir des propriétés profibrinolytiques.

Elle est obtenue par génie génétique, d’où le nom de STAR (staphylokinase recombinante). Le gène de la STA code une protéine de 163 acides aminés.

La STA mature comprend 136 acides aminés sur une chaîne polypeptidique unique sans pont disulfure.

Différentes formes moléculaires de la STA ont été purifiées, leurs poids moléculaires varient légèrement, de 16,5 à 18 kDa.

Le plasminogène et la STA forment un complexe inactif (plg.STA).

En présence de fibrine et de traces de plasmine à la surface d’un thrombus, le complexe plg.STA est converti en pli.STA qui transforme le plasminogène en plasmine.

Par ailleurs, la STA ne se lie pas à la fibrine, mais le complexe plasmine.STA a une forte affinité pour la fibrine grâce aux LBS de la plasmine.

La lyse d’un caillot plasmatique marqué à l’iode 125 dépend de la concentration de la STA ; 17 nmol/L de STA induisent en 2 heures la lyse de 50 % d’un caillot, avec seulement 5 % de fibrinogène dégradé.

Comparativement, 68 nmol/L de SK lysent 50 % du même caillot, mais avec 90 % de fibrinogène dégradé.

En l’absence de fibrine, la dégradation de 90 % de fibrinogène en 2 heures nécessite 790 nmol/L de STA, contre 4,4 nmol/L de SK.

Ces résultats montrent que la fibrinogénolyse est fortement moindre par la STA que par la SK.

La fibrinospécificité de la STA en milieu plasmatique est expliquée par l’inhibition très rapide du complexe pli.STA par l’alpha2-AP. Sur la surface de la fibrine, cette inhibition est ralentie de plus de 100 fois.

Ceci permet l’activation préférentielle du plasminogène à la surface du caillot.

La STA est libérée à partir du complexe pli.STA après sa neutralisation par l’alpha2-AP, et est recyclée vers d’autres molécules de plasminogène.

Des travaux récents ont réussi à synthétiser des STA recombinantes faiblement immunogènes et fortement fibrinospécifiques.

Plusieurs études cliniques ont démontré un effet thrombolytique au moins équivalent à celui du t-PA.

D - INHIBITEURS PHYSIOLOGIQUES DU SYSTÈME FIBRINOLYTIQUE :

Plusieurs types d’inhibiteurs contrôlent l’activité fibrinolytique, dont la plupart appartiennent à la famille des serpines.

Leur rôle majeur dans la circulation est de prévenir une activité fibrinolytique excessive.

1- Alpha2-antiplasmine (alpha2-AP) :

L’alpha2-AP est une glycoprotéine de 70 kDa organisée en une chaîne de 452 acides aminés ; elle contient approximativement 13 % d’hydrates de carbone.

Elle est synthétisée au niveau hépatique par l’expression d’un gène (désigné par PLI) situé sur le chromosome 17p13.

La concentration plasmatique de l’alpha2-AP est de l’ordre 1 µM, soit environ 70 mg/L, sa demi-vie est relativement longue, de l’ordre de 3 jours.

La réaction plasmine/antiplasmine est l’une des plus rapides en biologie.

L’alpha2-AP exerce trois fonctions principales ; elle inhibe la plasmine, elle interfère avec l’adsorption du plasminogène à la fibrine, et se fixe à la chaîne a de la fibrine.

Les sites situés sur la région C-terminale de l’alpha2-AP se lient d’une façon réversible au LBS des kringles 1 et 4 de la plasmine.

La Lys452 est le site majeur responsable de cette interaction, qui est extrêmement rapide avec une demi-vie de 0,1 seconde.

La constante kd de 2 x 10–10 M, illustre bien la très forte affinité pour la plasmine.

La lysine ou l’EACA se lient au LBS1 de la plasmine, et inhibent l’interaction alpha2-AP/plasmine.

Dans une seconde étape, un résidu sérine du site catalytique de la plasmine réagit avec les résidus Arg354-Met355 de l’inhibiteur, et libère un peptide de 11 kDa du côté C-terminal qui reste attaché d’une façon non covalente au LBS 1 et/ou LBS 4 de la plasmine.

Un mutant dans lequel l’Arg354 a été remplacée par l’Ala fait perdre l’activité inhibitrice de l’alpha2-AP.

Le complexe de 150 kDa qui en résulte est probablement maintenu par une nouvelle liaison formée : Serpli.Arga2-AP.

Le site de liaison à la fibrine est situé sur l’extrémité N-terminale de l’alpha2-AP.

La liaison croisée est catalysée par le facteur XIII activé par la création d’une liaison peptidique entre la Gln2 de l’alpha2-AP et un résidu Lys, probablement la Lys303 de la région C-terminale de la chaîne a de la fibrine.

L’activation systémique du système fibrinolytique, par exemple au cours d’un traitement thrombolytique, conduit à la génération des complexes plasmine/alpha2-AP qui peuvent être déterminés dans le plasma par une technique immunologique en « sandwich ».

Les déficiences en alpha2-AP peuvent causer des troubles hémorragiques.

2- Alpha2-macroglobuline (alpha2-M) :

L’alpha2-M est un inhibiteur à large spectre qui joue un rôle de fossoyeur des protéases au niveau du système sanguin.

L’alpha2-M est une glycoprotéine de 725 kDa contenant environ 10 % d’hydrates de carbone.

Elle est constituée de quatre sous-unités, chacune d’un PM de 160 kDa, reliées deux par deux par des ponts disulfures.

Ces demi-molécules sont associées de façon non covalente pour former la molécule intacte. Sa concentration plasmatique est de l’ordre de 2,5 g/L (3 µM).

Le gène de l’alpha2-M, désigné par A2M, est situé sur le chromosome 12p13.3-p12.3.

Plusieurs protéases réagissent avec l’alpha2-M. Une molécule d’alpha2-M est capable de se fixer à deux enzymes.

Le site actif des enzymes reste libre, et peut réagir avec des molécules de petite taille comme les substrats synthétiques.

L’alpha2-M est un inhibiteur de seconde ligne de défense de plusieurs composants du système fibrinolytique.

Elle inactive à un faible degré la kallikréine, le t-PA, le complexe SK-plg et les endopeptidases.

Si une activation du système fibrinolytique aboutit à la génération de grandes quantités de plasmine, l’alpha2-AP ne pourra pas neutraliser toute la plasmine formée, car la concentration du plasminogène plasmatique est environ deux fois plus forte que l’alpha2-AP.

Dans ces conditions, l’alpha2-M renforce l’action de l’alpha2-AP.

3- Inhibiteur de l’activateur du plasminogène de type 1 (PAI-1) :

Le PAI-1 est l’inhibiteur principal du t-PA et de l’urokinase à deux chaînes (tcu-PA).

C’est une glycoprotéine de 52 kDa, composée de 379 acides aminés ne contenant pas de cystéine (donc pas de ponts disulfures), ce qui pourrait expliquer son instabilité.

En plus de son activité antifibrinolytique, le PAI-1 joue un rôle dans la régulation des processus d’adhésion cellulaire et de remodelage tissulaire.

* Synthèse, régulation et métabolisme du PAI-1 :

Le PAI-1 est sécrété principalement par les cellules endothéliales et les cellules du stroma du tissu adipeux.

Il peut également être produit par les monocytes, les hépatocytes, les cellules musculaires lisses et les mégacaryocytes.

Chez les sujets normaux, plus de 90 % de PAI-1 se trouvent dans les plaquettes (pour la plupart sous une forme latente).

La concentration plasmatique du PAI-1 varie de quelques ng/mL à 100 ng/mL, son activité est comprise entre 0 et 50 U/mL.

Une U correspond à l’activité qui neutralise 1 U de sct-PA en 10 minutes. Le PAI-1 circulant existe sous trois formes différentes.

La forme active, liée à la vitronectine, à la glycoprotéine acide a1 et à la protéine SP40,40 interagit plus rapidement avec le tcu-PA et le tct-PA, et plus lentement avec le sct-PA.

Cette forme perd son activité spontanément avec une demi-vie d’environ 90 minutes, pour se transformer en une forme latente.

La troisième forme est le PAI-1 inactivé, complexé au t-PA. Les plaquettes activées libèrent du PAI-1 pour prévenir une lyse prématurée du clou hémostatique.

L’expression du PAI-1 est fortement régulée par de nombreux agents, comme les lipoprotéines de basse densité (LDL) oxydées et de très basse densité (VLDL), la thrombine, les liposaccharides, les hormones glucocorticoïdes et certaines cytokines, dont le facteur tumoral ou tumor necrosis factor (TNF), le transforming growth factor (TGF)b et l’interleukine 1.

La synthèse du PAI-1 est associée à la croissance cellulaire.

La transcription de l’acide ribonucléique messager (ARNm) est multipliée par 20 au cours de la transition G0 à G1 des cellules épithéliales.

* Structure du gène du PAI-1 :

Le gène du PAI-1 (PLANH1) est situé sur le chromosome 7 au niveau de la bande q21-q22, sur une longueur de 12,2 kb.

Il existe deux ARNm, l’un de 2,4 et l’autre de 3,2 kb.

Dans la région 5’ du gène se trouve une multitude d’éléments cis-régulateurs qui interagissent avec les facteurs de transcription pour moduler l’expression du PAI-1.

Chez l’homme, les déficiences héréditaires du PAI-1 peuvent provoquer des saignements spontanés à la suite d’actes chirurgicaux.

Cette anomalie est corrigée par l’administration orale d’inhibiteurs de la fibrinolyse, comme l’acide trans-4-aminométhylcyclohexane- 1-carboxylique (AMCHA).

Huit polymorphismes génétiques ont été mis en évidence, mais le seul qui ait été étudié de façon approfondie est le polymorphisme localisé au niveau du nucléotide -675 du promoteur par l’insertion ou la délétion d’une guanine.

Les individus avec un génotype 4G/4G possèdent un taux plus élevé de PAI-1 que le génotype 5G/5G.

Le polymorphisme 4G est associé à une légère augmentation d’accidents coronariens et de mortalité dans les septicémies méningococciques.

* Inhibiteurs du PAI-1 :

De grands efforts ont été réalisés dans la recherche de composés susceptibles d’inhiber la synthèse ou l’activité du PAI-1.

Ces composés pourraient êtres utiles pour augmenter l’activité fibrinolytique constitutive, pour potentialiser l’efficacité du traitement thrombolytique ou pour exercer une activité antithrombotique.

Le gemfibrozil et le clofibrate réduisent de 40 à 50 % la synthèse du PAI-1 en 24 heures par les hépatocytes.

Un peptide de 14 acides aminés du centre réactif de PAI-1 inhibe rapidement l’activité du PAI-1 et la formation du complexe t-PA/PAI-1.

In vitro, il augmente la lyse du caillot riche en plaquettes.

Le sidéroxylonal C, extrait d’Eucalyptus albens, inhibe l’activité du PAI-1 sur le t-PA in vitro.

Les inhibiteurs de faible poids moléculaire, comme le dérivé de l’acide flufénamique (ARHO29953XX), inhibent le C’1-inhibiteur et la formation du complexe t-PA/PAI-1 par sa liaison à l’Arg76 et/ou à l’Arg118 du site actif du PAI-1.

Très récemment, un nouvel inhibiteur de PAI-1, appelé fendosal ou HP129, a montré son efficacité par rapport aux autres inhibiteurs appelés AR-H029953XX, XR1853, XR5118 et le peptide TVASS. Selon cette étude, l’IC50 d’inhibition du PAI-1 par le fendosal et le XR5118 sont respectivement de 15 µM et de plus de 1 000 µM.

* Physiopathologie du PAI-1 :

Le PAI-1 plasmatique est augmenté dans un grand nombre d’états pathologiques, comme l’infarctus du myocarde, l’obésité, le diabète et l’insulinorésistance, l’hypertriglycéridémie, après chirurgie cardiaque, pendant la grossesse et dans les états inflammatoires.

Dans les septicémies à méningocoques, des concentrations élevées de PAI-1 sont associées à un haut risque de mortalité.

Le PAI-1 ne paraît pas être un facteur de risque des thromboses veineuses profondes (TVP).

Dans l’étude ECAT DVT, comprenant 480 patients avec arthroplastie de la hanche, aucune corrélation n’a été trouvée entre taux de PAI-1 (antigène et activité) et la survenue d’une TVP après chirurgie orthopédique.

Dans une étude prospective de 303 patients avec un premier épisode de TVP, une exploration détaillée du système fibrinolytique a été exécutée pendant le traitement et après arrêt du traitement par des anticoagulants oraux.

Les malades furent suivis pendant 3 ans.

Aucune différence significative ne fut trouvée entre le taux du PAI-1 (antigène et activité), du t-PA, temps de lyse des euglobulines et une récurrence de TVP.

En revanche, une concentration plasmatique élevée de PAI-1 paraît être un facteur de risque pour l’infarctus du myocarde (IDM).

Dans l’étude ECAT comprenant plus de 3 000 patients, les taux d’antigène et d’activité de PAI-1 étaient associés de façon significative à la survenue d’un IDM.

Cependant, après analyse multivariée, il s’avérait que le PAI-1 n’était plus un facteur de risque indépendant, mais associé à l’insulinorésistance.

Dans une autre étude, il a été démontré que la concentration plasmatique du complexe t-PA/PAI-1 est très fortement corrélée à l’activité de PAI-1 et au t-PA antigène.

Ces facteurs, et principalement le complexe t-PA/PAI-1, sont prédictifs de la survenue de l’IDM chez les patients ayant une angine de poitrine ou un IDM récent.

4- Inhibiteur de l’activateur du plasminogène de type 2 (PAI-2) :

Le PAI-2 appartient à un sous-groupe de serpines.

Il a été identifié et purifié à partir du placenta humain et des lignées cellulaires monocytaires (U-937).

Il est prédominant dans l’oesophage, la cornée, la langue, les muqueuses buccales et vaginales.

Le PAI-2 existe sous deux formes, glycosylée de 60 kDa, ou non glycosylée de 47 kDa. Les sites de glycosylation se trouvent au niveau de l’Asn75, l’Asn115 et l’Asn339.

Le gène du PAI-2, désigné par PLANH2, est localisé sur le chromosome 18 au niveau de la bande q22.1, sur 16,5 kb.

L’ARNm de 1,9 kb code une protéine de 415 acides aminés.

Le PAI-2 est cinq fois plus actif sur le tcu-PA que sur le tct-PA, moins actif sur le sct-PA, et sans effet sur la scu-PA.

Il n’a pas d’effet important sur la lyse du caillot intravasculaire, mais joue probablement sur la régulation de la protéolyse dans les tissus.

Dans le plasma normal, le taux de PAI-2 est très faible.

Il est élevé pendant la grossesse, et dans certaines leucémies myéloblastiques de type M4 et M5.

Le PAI-2 peut être un marqueur de dysfonctionnement placentaire.

La destruction du gène du PAI-2 de souris ne provoque aucune anomalie phénotypique.

Un niveau élevé de PAI-2 peut limiter la progression de certaines tumeurs malignes.

Certaines études suggèrent que le PAI-2 inhibe la lyse cellulaire et l’apoptose induites par le TNF-a ainsi que les effets de certaines infections bactériennes et virales.

5- Glycoprotéine riche en histidine (HRGP) :

La protéine native d’un PM voisin de 75 kDa contient 507 acides aminés et une séquence riche en histidine (séquence 330 à 389) analogue à celle du kininogène humain et bovin.

La protéine native ne résiste pas au processus de purification, et se dégrade rapidement au cours de sa préparation.

La concentration plasmatique normale de l’HRGP est de l’ordre de 1,5 µM, soit environ 100 mg/L, avec une demi-vie d’environ 3 jours.

La molécule d’HRGP se lie aux LBS du plasminogène, et s’apparente ainsi par son mécanisme d’action à l’EACA par son affinité au LBS1 du plasminogène (Kd = 1 µM).

Cependant et contrairement aux acides aminés antifibrinolytiques, l’HRGP a peu d’effet sur l’activation du plasminogène.

Elle est synthétisée par le foie, et son taux est très abaissé dans les atteintes hépatiques.

On peut noter une légère diminution chez les malades présentant une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD).

Une diminution de 25 % s’observe chez les femmes soumises à un traitement contraceptif oral, et au cours de la grossesse où l’abaissement peut être plus important.

Une déficience congénitale hétérozygote a été décrite chez une seule famille.

6- Inhibiteur de la C’1-estérase :

C’est une glycoprotéine fortement glycosylée, capable d’inhiber la plasmine et la kallikréine plasmatique.

Son action inhibitrice serait liée à une inhibition du système fibrinolytique induite par les facteurs XII et XI activés.

Son PM est de 105 kDa, et sa concentration plasmatique, de 1,7 µM, est équivalente à celle d’autres inhibiteurs comme l’alpha2-AP, l’alpha2-M et la HRGP (1-3 µM).

Le gène de l’inhibiteur de la C’1-estérase est localisé sur le chromosome 1, sur une longueur de 17 kb.

La déficience congénitale de la C’1-estérase peut provoquer des attaques d’oedème angioneurotique héréditaire.

Ces attaques sont associées à une activation du système fibrinolytique, avec génération de kallikréine et de plasmine.

Des traitements par des agents antifibrinolytiques comme l’AMCHA sont prescrits.

7- Lipoprotéine(a) : lp(a)

La lipoprotéine(a) présente un large polymorphisme de PM, allant de 800 à 1 300 kDa, sa concentration plasmatique varie de 10 à 1 000 mg/L.

Le gène de la lp(a) est localisé sur le chromosome 6 au niveau de la bande q26-27.

Tout comme le plasminogène, la lp(a) contient des kringles qui interagissent avec les résidus lysine C-terminaux de la fibrine, de la matrice extracellulaire et des protéines de la surface cellulaire.

Elle entre en compétition avec le plasminogène et le t-PA pour se lier à ces lysines, et exerce ainsi son effet antifibrinolytique.

Un taux élevé de lp(a) est un facteur de risque de l’IDM.

Cependant, des travaux récents ont démontré que ce sont surtout les isoformes de lp(a), de plus petite taille à forte affinité pour la fibrine, qui sont responsables de ce risque.

8- Inhibiteur de la fibrinolyse activable par la thrombine (TAFI) :

Le TAFI (encore appelé : procarboxypeptidase B, procarboxypeptidase U ; U pour instable), est une glycoprotéine synthétisée par le foie et constituée de 417 acides aminés, d’un PM apparent de 60 kDa. Sa concentration plasmatique est de l’ordre de 75 nM.

Le zymogène TAFI est activé par le complexe thrombinethrombomoduline ou par la plasmine après clivage de la molécule au niveau de l’arginine en position 92 ; il libère alors un peptide actif appelé TAFI activé (TAFIa) de 35 kDa.

Le TAFIa inhibe la fibrinolyse en détachant des résidus lysine au niveau C-terminal de la fibrine partiellement dégradée, réduisant ainsi la fixation du plasminogène à la fibrine.

Le taux de TAFI plasmatique est très variable.

Il est contrôlé génétiquement, mais est également influencé par des états pathologiques.

Ainsi, le TAFIa est fortement réduit dans l’insuffisance hépatique et dans l’hémophilie A et significativement augmenté dans le diabète de type 2, l’obésité et l’insulinorésistance.

Des concentrations élevées de TAFI sont associées à un risque élevé de TVPs et sont plus fréquentes chez les malades souffrant d’angine de poitrine stable par rapport aux sujets sains.

Cependant, chez la souris, la destruction du gène du TAFI ne produit aucune altération du phénotype.

Le gène du TAFI est localisé sur le chromosome 13, sur une longueur de 46 kb, il est organisé en 13 exons.

Plusieurs polymorphismes ont été décrits dans la région promotrice et dans la région 3’. Certaines combinaisons morphotypiques influencent fortement les taux circulants de TAFI.

E - INHIBITEURS UTILISÉS EN THÉRAPEUTIQUE :

Ils peuvent être classés en deux groupes : les inhibiteurs chimiques et les inhibiteurs enzymatiques extraits d’organes.

1- Acide epsilon amino-caproïque (EACA) :

L’EACA se fixe aux LBS du plasminogène et de la plasmine, et empêche ainsi ces molécules de s’attacher aux résidus lysine C-terminaux de la fibrine.

Lors de sa fixation au glu-plasminogène, ce dernier subit un changement de conformation vers une forme plus ouverte, ce qui stimule l’activation du plasminogène par les activateurs du plasminogène.

Cet effet catalyseur de l’EACA n’a cependant pas de conséquences physiologiques, puisque l’EACA inhibe efficacement l’action de la plasmine à des concentrations supérieures ou égales à 10–4 M.

L’EACA est bien absorbé après administration orale, et rapidement excrété par voie rénale, avec une demi-vie de l’ordre de 90 minutes, d’où les concentrations urinaires 50 à 100 fois supérieures à celles du plasma.

Cet agent antifibrinolytique est utilisé dans des conditions associées à une stimulation de l’activité fibrinolytique, comme la chirurgie cardiaque avec circulation extracorporelle, la transplantation orthotopique du foie, les attaques d’oedème angioneurotique héréditaire et les hémorragies incontrôlables provenant d’une prostatectomie.

Lors d’interventions chirurgicales, on administre généralement par voie intraveineuse une dose de charge de 50 mg/kg pendant 20 minutes, suivie d’une dose de 25 mg/kg par heure.

Ce dosage est suffisant pour maintenir une concentration plasmatique égale à 260 mg/L, qui est le double de la concentration nécessaire pour l’inhibition de la fibrinolyse.

Ce schéma réduit de 50 % la perte sanguine lors de la chirurgie cardiaque avec circulation extracorporelle.

2- Acide tranéxamique (AMCHA) :

Comme l’EACA, l’AMCHA est un analogue de la lysine.

Son mode d’action, sa pharmacocinétique et son utilisation clinique sont identiques à ceux de l’EACA ; toutefois il est six à dix fois plus actif que ce dernier.

Une inhibition de 80 % de l’activité fibrinolytique est atteinte avec des concentrations plasmatiques de 10 mg/L.

L’administration d’EACA ou d’AMCHA n’est pas sans risque.

Plusieurs cas d’accidents thrombotiques ont été décrits.

L’utilisation de ces agents antifibrinolytiques lors d’hémorragies du tractus urinaire supérieur est contre-indiquée, à cause du risque de formation de thrombi dans l’uretère.

3- Aprotinine (Trasylolt, Antagosant) :

L’aprotinine est un polypeptide basique de 6 500 kDa, extrait du poumon de boeuf.

C’est un puissant inhibiteur de la plasmine, de la kallikréine et de la trypsine.

Outre son rôle antifibrinolytique, l’aprotinine inhibe à un degré moindre le FXIIa, le FIXa et pour certains auteurs, le complexe FVIIa-facteur tissulaire.

Par conséquent, l’aprotinine agit aussi comme un agent antithrombotique.

L’activité de l’aprotinine est exprimée en unités inhibant l’activité de la kallikréine (KIU) ; 106 unités KIU correspondent à 140 mg de protéine pure.

Après une administration intraveineuse, l’aprotinine se distribue rapidement dans les espaces extracellulaires ; le volume de distribution apparent dépasse 20 L.

La demi-vie de distribution est de 0,7 à 2,5 heures, et la demi-vie d’élimination est de 7 à 10 heures.

L’aprotinine est l’inhibiteur le plus utilisé dans la chirurgie cardiaque avec circulation extracorporelle, et dans la transplantation orthotopique du foie.

Dans ces deux types d’interventions, une dysfonction plaquettaire due à l’activation du PAR-1 (protease activated receptor 1) par la thrombine et/ou la plasmine est observée.

Grâce à son activité antithrombotique et antifibrinolytique, l’aprotinine diminue l’activation protéolytique des plaquettes.

De fortes doses d’aprotinine (dose de charge de 106 KIU), suivies d’une perfusion continue de 5 × 105 KIU/h, réduisent les pertes de sang de 50 % environ.

L’aprotinine peut provoquer des réactions anaphylactiques.

4- Inhibiteur de Kunitz (Iniprolt) :

C’est un polypeptide extrait du pancréas, inhibiteur de plusieurs protéases, en particulier de la plasmine, de la trypsine, de la chymotrypsine et de la kallikréine.

Physiologie du système fibrinolytique :

Dans un plasma normal, l’activité fibrinolytique est quasiment nulle, car le t-PA existe sous forme de traces et la scu-PA n’a pas d’activité enzymatique.

Aucune forme de plasmine circulante n’est détectée, même si le taux de t-PA augmente de 20 à 100 fois par rapport à son niveau basal au cours d’un exercice physique intense ou après une injection intraveineuse de DDAVP à des volontaires sains, ou après un test d’occlusion veineuse.

Le t-PA a une faible affinité pour le plasminogène en l’absence de fibrine, mais son efficacité est augmentée considérablement (plusieurs centaines de fois) en présence de fibrine.

Au cours des premières phases de formation de la fibrine, le t-PA et le plasminogène se lient instantanément à celleci, et forment un complexe ternaire t-PA/plasminogène/fibrine.

Le plasminogène se lie à la fibrine par le biais de ses LBS. La plasmine générée permet le clivage protéolytique de la fibrine au niveau de l’extrémité C-terminale de la chaîne a et fait apparaître de nouveaux résidus Lys-C-terminaux.

Le Glu-plg se lie plus facilement à la fibrine dégradée qu’à la fibrine native, non dégradée.

La scu-PA se lie avec une grande affinité au Glu-plg lié aux Lys-C-terminales de la fibrine dégradée, et l’active sélectivement.

De plus, la plasmine formée sous forme de traces active la scu-PA monocaténaire inactive en tcu-PA bicaténaire active.

Dans les vaisseaux sanguins, une lésion endothéliale active localement le système contact par l’interaction du facteur XII avec le sous-endothélium.

L’activation de la phase contact de la coagulation génère le FXII activé, capable de convertir le plasminogène et la prékallikréine respectivement en plasmine et en kallikréine qui peuvent convertir la scu-PA en tcu-PA.

Au cours de la génération de thrombine, une partie forme un complexe avec la thrombomoduline.

Le complexe thrombine/ thrombomoduline active d’une part, la protéine C, qui inhibe la coagulation, et d’autre part le TAFI, qui inhibe la fibrinolyse par le clivage des lysines C-terminales de la fibrine, ce qui aboutit à une diminution de la liaison du plasminogène aux résidus lysine.

L’activité fibrinolytique globale ou locale est régulée par les serpines.

Le sct-PA, le tct-PA, le tcu-PA sont inhibés par le PAI-1 en excès par rapport au t-PA.

Le traitement thrombolytique par la SK, l’APSAC, le t-PA ou par la tcu-PA provoque une activation massive de la fibrinolyse et une génération importante de plasmine.

Dans ces conditions, l’alpha2-M renforce l’action inhibitrice de l’alpha2-AP insuffisante pour inhiber toute la plasmine formée.

La régulation de l’activité fibrinolytique est assurée en partie par deux types de récepteurs : ceux qui localisent les activateurs du plasminogène sur les cellules et augmentent le processus d’activation, et ceux qui les éliminent de la circulation.

Les facteurs du système de plasminogène sont fortement modulés et plus spécialement le t-PA, le PAI-1 et l’u-PAR, par des hormones, des facteurs de croissance, des cytokines, les LDL oxydés, les VLDL et les liposaccharides.

A - ANALOGIE COAGULATION-FIBRINOLYSE :

L’étude du schéma de la fibrinolyse et de ses facteurs appelle quelques remarques.

En effet, certaines analogies sont à souligner entre coagulation et fibrinolyse.

Le sang renferme deux systèmes enzymatiques qui se ressemblent, mais dont l’action est antagoniste. Les deux systèmes comprennent une proenzyme inactive, la prothrombine dans la coagulation et le plasminogène dans la fibrinolyse.

Dans les deux cas, le précurseur est transformé en enzyme active, thrombine et plasmine respectivement qui sont des sérines protéases.

La thrombine convertit le fibrinogène en fibrine, la plasmine dégrade la fibrine en libérant de nombreux fragments polypeptidiques.

Il est intéressant de constater que les deux systèmes sont régulés par des antiprotéases, l’antithrombine dans la coagulation, l’antiplasmine et le PAI-1 dans la fibrinolyse.

L’hypercoagulabilité peut induire une hyperfibrinolyse (locale ou systémique) qui se manifeste par une augmentation des produits de dégradation de la fibrine, les D-dimères.

Un excès de fibrinolyse peut entraîner des accidents hémorragiques, par exemple au cours de traitements thrombolytiques et dans certains états pathologiques constitutionnels et acquis.

En revanche, une insuffisance du système fibrinolytique est considérée comme pouvant prédisposer aux thromboses.

Un petit nombre d’observations démontre bien le rôle de la fibrinolyse dans la prévention des dépôts de fibrine.

Il s’agit, comme déjà indiqué plus haut, de sujets ayant un déficit homozygote en plasminogène, et chez lesquels des dépôts de fibrine peuvent survenir au niveau des conjonctives (Conjunctivitis lignosa).

Cette constatation est convaincante quant au rôle du système fibrinolytique in vivo.

B - ACTION DE LA PLASMINE SUR LE COMPLÉMENT. RÔLE DU SYSTÈME FIBRINOLYTIQUE DANS L’INFLAMMATION :

Pour certains auteurs, la fibrinolyse interviendrait à la fois dans la dégradation des dépôts extravasculaires de fibrine et dans la genèse de phénomènes inflammatoires.

La plasmine est formée in situ, dans le foyer inflammatoire, après libération des activateurs du plasminogène au cours de la lyse de différentes cellules se produisant au cours du processus inflammatoire.

La plasmine est capable d’activer la prékallikréine en kallikréine, entraînant la formation d’une quantité plus importante de plasmine qui active directement le premier composant du complément C1q, et participe ainsi à l’installation de la réaction inflammatoire.

Lors de la protéolyse de C2, l’un des fragments formés possède une activité comparable à celle des kinines.

De plus, les fragments C3a et C5a, provenant respectivement de la scission de C3 et de C5 lors de l’activation du système du complément, entraînent une augmentation de la perméabilité vasculaire et exercent un effet chimiotactique sur les polynucléaires.

Le fragment C5b, uni aux composants C6 et C7, forme un complexe trimoléculaire doué également d’un pouvoir chimiotactique sur les leucocytes.

De plus, l’activation des deux derniers composants C8 et C9 aboutit à la lyse de la cellule.

Récemment, il a été démontré que l’u-PAR, ainsi que sa forme soluble, se lie au récepteur chimiotactique FPRL1/LXA4R.

Cette interaction établit un nouveau lien entre le système du plasminogène et l’inflammation.

C - RÔLE DU SYSTÈME FIBRINOLYTIQUE DANS LE REMODELAGE TISSULAIRE ET L’INVASION TUMORALE :

La plupart des cellules cancéreuses contiennent des facteurs procoagulants et fibrinolytiques.

Pour l’invasion tissulaire, la cellule a besoin d’enzymes capables de dégrader la matrice extracellulaire et la fibrine qui se trouve souvent à la périphérie d’une tumeur maligne.

Plusieurs chercheurs ont démontré que l’u-PA et l’u-PAR se trouvent souvent en préférence dans l’apex d’une cellule cancéreuse (partie située en avant de la direction de progression).

C’est à cet endroit que ce complexe peut activer le plasminogène qui se trouve de façon ubiquiste dans les tissus, et le convertir en plasmine.

La plasmine ne dégrade pas seulement la fibrine, mais peut activer certains précurseurs des facteurs de croissance et des prométalloprotéinases (proMMP) en métalloprotéases actives (MMP).

Ces MMP participent également à la dégradation de la matrice extracellulaire.

Le PAI-1 inhibe l’action protéolytique de l’urokinase au niveau des cellules.

On pouvait donc penser que le PAI-1 pourrait se comporter comme un inhibiteur de l’invasion cellulaire.

Or, les résultats expérimentaux ont montré qu’au contraire le PAI-1 était impliqué dans la migration cellulaire.

Bien que le PAI-1 neutralise l’urokinase, son rôle dans l’invasion des cellules cancéreuses a été suspecté depuis longtemps.

En effet, dans les cancers, il a été montré que l’urokinase, mais aussi de façon paradoxale le PAI-1, étaient des facteurs de mauvais pronostic indépendants.

Enfin, un excès de PAI-1 peut inhiber l’adhésion des cellules à la vitronectine.

Ceci pourrait expliquer pourquoi des taux élevés de PAI-1 sont de mauvais pronostic dans les cancers.

Il semblerait que le PAI-2 ne joue pas de rôle important dans la thrombolyse, mais aurait des fonctions pour limiter la protéolyse dans les tissus.

Du PAI-2 a été trouvé dans les cancers du sein à la fois au niveau des cellules cancéreuses et des cellules stromales.

Contrairement au PAI-1, des taux élevés de PAI-2 seraient un facteur pronostique favorable.

Une très grande bibliographie (plusieurs milliers d’articles scientifiques) existe sur l’action des activateurs du plasminogène et de leurs inhibiteurs dans la migration cellulaire, l’invasion tumorale, dans la métastatisation, et aussi dans le remodelage des tissus, dans l’embryogenèse et la cicatrisation des plaies.

Il est hors sujet de cet article de décrire en détail les multiples interactions entre système fibrinolytique et cancer, et le lecteur est prié de consulter des revues récentes.

Exploration de la fibrinolyse :

Différents tests peuvent être utilisés : les plus couramment employés sont détaillés dans les manuels de techniques hématologiques, et dans un ouvrage spécialisé qui rassemble l’ensemble des méthodes disponibles.

L’exploration de la fibrinolyse sera différente selon que l’on recherche une hyperfibrinolyse qui prédispose au saignement, ou une hypofibrinolyse qui favorise la thrombose.

Dans leur ensemble, les examens de laboratoires globaux ont été mis au point pour la recherche d’une augmentation de l’activité fibrinolytique, et rarement pour mettre en évidence une hypofibrinolyse.

Plus récemment, les dosages spécifiques des différents paramètres du système fibrinolytique ont été mis au point.

A - DÉTECTION DES HYPERFIBRINOLYSES :

1- Tests globaux :

* Lyse du caillot sanguin :

La méthode d’étude la plus ancienne et la plus simple de l’activité fibrinolytique globale est l’observation de la lyse du caillot sanguin.

Le temps de lyse du caillot de sang total est normalement supérieur à 72 heures.

Il est inférieur à 1 heure dans les fibrinolyses suraiguës avec, exceptionnellement, une incoagulabilité du sang recueilli, traduisant la disparition de tout le fibrinogène circulant par protéolyse.

Dans ce cas, l’addition de fibrinogène normal et de la thrombine dans le sang permet d’objectiver la formation d’un caillot suivie de sa lyse très rapide.

Des résultats intermédiaires avec des temps de lyse de quelques heures peuvent être observés.

* Thromboélastographie :

Elle permet d’objectiver la fibrinolyse, en donnant un diagramme caractéristique en fuseau ou en toupie.

L’addition d’un agent antifibrinolytique corrige le tracé et confirme l’existence d’une hyperfibrinolyse.

Des techniques ont été mises au point, pour augmenter la sensibilité de ces méthodes et réduire le temps de réponse en situation d’urgence.

* Temps de lyse d’un caillot provenant de sang dilué :

La dilution du sang, en réduisant l’action des inhibiteurs, sensibilise le test puisque, par le test de Fearnley-Gallimore, le temps de lyse chez un sujet normal est de 5 à 12 heures, au lieu de plus de 72 heures pour le sang entier.

Il faut cependant savoir que le taux de PAI-1 influence le test de Fearnley-Gallimore.

* Temps de lyse du caillot des euglobulines ou test de von Kaulla :

La précipitation des euglobulines plasmatiques à pH 5,9 entraîne une élimination incomplète des inhibiteurs de la lyse tels que l’alpha2- antiplasmine, l’alpha2-macroglobuline, le PAI-1 en partie et l’ATIII.

Dans le précipité, on trouve essentiellement le plasminogène, le t-PA, une partie du PAI-1, et le fibrinogène.

Cette élimination importante des inhibiteurs du système fibrinolytique permet d’obtenir des temps de lyse plus courts, et de réduire les délais de réponse.

Ainsi, le temps de dissolution du caillot des euglobulines chez un sujet normal est supérieur à 3 heures.

Il y a correspondance entre le temps de lyse obtenu et l’intensité du syndrome fibrinolytique.

Puisque le PAI-1 ne précipite que partiellement lors de la précipitation des euglobulines, son taux influence le temps de lyse.

Il faut signaler qu’en cas de traitement par un agent antifibrinolytique, celui-ci échappe à la précipitation des euglobulines, et le résultat du test ne tient alors pas compte de l’activité de l’inhibiteur thérapeutique (exemple l’EACA).

Il en est de même de l’héparine, qui reste dans le surnageant et n’empêche pas la coagulation des euglobulines.

Celle-ci n’a pas lieu en l’absence de fibrinogène (grandes défibrinations).

Il faut alors ajouter un petit volume d’une solution d’euglobulines normales ou de fibrinogène.

Au cours de la chirurgie cardiaque avec circulation extracorporelle, le test des euglobulines reste utilisable, malgré l’importance de l’héparinémie qui rend le sang mais non les euglobulines incoagulables.

* Mesure de la capacité fibrinolytique globale (CFG) :

Ce test permet l’évaluation de la capacité fibrinolytique globale d’un plasma, en mesurant les produits de dégradation de la fibrine générés à partir d’une tablette de fibrine standardisée en présence d’une quantité faible et constante de t-PA (10 ng/mL) utilisée pour amorcer la réaction.

Le taux initial de D-dimères dans le plasma à tester doit être déduit du taux de D-dimères mesuré.

Le taux de D-dimères peut être dosé de manière quantitative par le STAt- Liatestt ou semi-quantitative en utilisant le test d’agglutination de particules de latex sensibilisées avec un anticorps monoclonal anti- D-dimère humain.

Le test CFG (Stago, France) est conçu pour évaluer l’hypofibrinolyse comme facteur de risque possible des maladies cardiovasculaires et thromboemboliques.

Ce test est en cours d’évaluation et ne peut pas être recommandé en routine.

Une nouvelle méthode de contrôle de l’équilibre de coagulation et fibrinolyse a été récemment mise au point. Sa relative simplicité pourrait permettre son utilisation en clinique.

2- Tests analytiques :

* Dosage du plasminogène :

Les méthodes d’immunodiffusion radiale et d’immunoélectrophorèse sont des techniques directes, simples et reproductibles, avec comme seul inconvénient leur incapacité à faire la différence entre une protéine intacte et fonctionnelle et une protéine dégradée, dénaturée ou une mutation non fonctionnelle.

La seule technique qui a montré son utilité est celle, utilisant de la SK, qui forme un complexe actif avec le plasminogène (SK.Plg).

L’activité amidolytique de la plasmine formée est mesurée sur un substrat synthétique chromogénique de faible poids moléculaire (tripeptide couplé à la paranitroaniline comme le S-2251).

Si la quantité de SK est en excès par rapport au plasminogène présent, le taux de paranitroaniline formée est proportionnel à la quantité de plasminogène.

La SK peut être remplacée par du t-PA dans une autre technique considérée comme plus proche de la physiologie.

Ces techniques ne peuvent pas être appliquées sur les plasmas des patients ayant reçu un traitement thrombolytique, car le plasminogène est préalablement converti en plasmine qui se lie très rapidement aux antiplasmines.

La concentration plasmatique normale du plasminogène est de l’ordre de 2 µM, soit 200 µg/mL.

* Dosage du t-PA :

+ Méthodes immunologiques :

Les méthodes de dosage du t-PA antigène sont des techniques immunoenzymatiques (Elisa : enzyme-linked immunosorbent assay).

Elles utilisent des anticorps spécifiques ou des fragments F(ab’)2 et un deuxième anticorps couplé à la peroxydase ou à la b-Dgalactosidase.

Le taux de t-PA d’un échantillon est évalué par l’intensité de la fluorescence ou de la coloration d’un substrat spécifique, comme l’orthophénylènediamine méthylumbelliféryl ou le b-D-galactoside.

Plusieurs coffrets sont actuellement commercialisés.

La plupart utilisent le fragment F(ab’)2 pour éviter les interférences avec les anticorps anti-IgG ou les facteurs rhumatoïdes présents dans le plasma.

Il existe d’autres coffrets qui permettent de différencier le t-PA libre et celui complexé au PAI-1.

La valeur moyenne de référence est comprise entre 6 et 7 ng/mL.

+ Méthodes biologiques :

Elles apprécient l’activité fonctionnelle du t-PA sur du plasminogène exogène, fixé sur un anticorps monoclonal immobilisé sur les puits d’une microplaque en polystyrène.

La plasmine formée après activation du plasminogène est déterminée par son action sur un substrat chromogène spécifique de la plasmine, en libérant de la p-nitroaniline détectée à 405 nm.

L’activité du t-PA est déterminée par extrapolation sur une courbe d’étalonnage obtenue en utilisant différentes dilutions de t-PA standard incubé dans les mêmes conditions.

Les valeurs moyennes de t-PA activité, rapportées par différentes méthodes, sont très variables.

Celles obtenues par deux méthodes Elisa varient respectivement de 0,27 à 0,38 UI/mL, et 0,53 à 0,69 UI/mL.

* Dosage de l’urokinase et de la pro-urokinase :

L’urokinase peut être quantifiée par une méthode Elisa en utilisant des microplaques de titration chargées avec un anticorps de lapin anti-urokinase.

La détection est faite à l’aide d’un second anticorps anti-IgG conjugué à la phosphatase alcaline.

Ce test spécifique de l’urokinase ne tient pas compte des différentes formes de l’urokinase : la pro-urokinase, l’urokinase active ou l’urokinase complexée avec ses inhibiteurs.

L’activité de l’urokinase peut être mesurée par des techniques immunologiques, en utilisant des anticorps polyclonaux anti-UK immobilisés dans les puits d’une microplaque comme pour le dosage de l’UK antigène.

On peut mesurer d’une part l’activité spécifique de l’urokinase fixée aux anticorps (l’UK active) à l’aide d’un substrat de la plasmine, et d’autre part la pro-urokinase immobilisée après son activation en urokinase, en rajoutant de faibles quantités de plasmine à 1 mU/mL.

La concentration normale de l’urokinase est de l’ordre de 2 ng/mL.

Très récemment, des méthodes de dosage du récepteur de l’urokinase ont été commercialisées.

Le coffret Quantikinet permet le dosage du récepteur humain de l’urokinase par une méthode Elisa.

La concentration plasmatique déterminée par cette méthode est de 2,24 ng/mL (plasma hépariné) et de 3,48 ng/mL (plasma EDTA) (R & D systems Europe Ltd, Quantikine t Human uPAR ELISA Kit, UK).

* Dosage du PAI-1 et du PAI-2 :

Au cours des dernières décennies, un grand nombre de méthodes immunologiques du dosage du PAI-1 antigène a été développé.

Au cours des premières phases de développement de ces techniques, les différentes formes de PAI-1 ont posé le problème de la spécificité de l’anticorps à utiliser.

Les problèmes de dosage du PAI-1 antigène sont souvent associés aux variations circadiennes et à la compartimentation du PAI-1 (plasmatique ou plaquettaire).

Par conséquent, il faut respecter les conditions de prélèvement, et éviter l’activation plaquettaire en rajoutant des agents antiagrégants à la solution anticoagulante utilisée pour le prélèvement de sang.

Le PAI-1 antigène est en grande partie stocké dans les plaquettes sous une forme en grande partie inactive, et représente 90 à 95 % du PAI-1 sanguin, 5 à 10% restent plasmatiques.

En revanche, le PAI-1 activité mesuré dans le sang est de 6 à 15% par rapport à l’activité totale de PAI-1, dont 3 à 6% sont plasmatiques et 3 à 9% sont plaquettaires.

Plusieurs méthodes :

Elisa sont proposées sous forme de coffretsréactifs, et sont de plus en plus nombreuses (environ 15 en l’an 2002).

Ces méthodes peuvent identifier les différentes formes de PAI-1 par leur spécificité vis-à-vis des formes active, latente ou complexée.

La concentration de PAI-1 antigène est de l’ordre de quelques ng/mL à 100 ng/mL.

La concentration du PAI-2 est inférieure à 5 ng/mL, mais son taux augmente d’une manière très importante chez la femme enceinte.

* Dosage des antiplasmines :

L’alpha2-M peut être dosée par immunodiffusion radiale.

L’alpha2-AP est évaluée soit par sa concentration antigénique par immunoélectrophorèse selon la technique de Laurell, soit par son activité fonctionnelle.

Cette dernière est appréciée par le pouvoir de neutralisation de l’alpha2-AP sur une quantité donnée (et en excès) de plasmine.

La plasmine non neutralisée est évaluée par sa propriété amidolytique sur un substrat synthétique chromogénique.

Toutefois, l’utilisation d’un tel substrat réduit la spécificité de la méthode, puisque le complexe alpha2-M-plasmine, inactif sur la fibrine, est capable d’hydrolyser les substrats synthétiques.

La concentration plasmatique de l’alpha2-AP est de l’ordre de 70 µg/mL, soit 1 µM.

Celle de l’alpha2-M est de 2,5 mg/mL, soit 3 µM.

* Recherche des complexes plasmine-antiplasmine :

Elle est basée sur le fait qu’il existe dans les complexes plasmineantiplasmine des déterminants antigéniques absents du plasminogène.

Les anticorps monoclonaux qui réagissent avec les composants plasmine des complexes permettent le dosage des complexes plasmine-antiplasmine à l’aide des techniques immunoenzymatiques.

Les résultats, comparés à ceux des complexes thrombine-antithrombine, permettent d’évaluer l’importance respective de l’activation de la coagulation et de celle de la fibrinolyse.

Cette comparaison est utile en particulier dans les CIVD.

* Dosage de l’HRGP :

Le dosage de l’HRGP antigène dans le plasma humain se fait par une technique d’immunoélectrophorèse selon Laurell utilisant un antisérum de lapin.

La concentration plasmatique dans une population d’adultes est de l’ordre de 92 ± 45 mg/L.

Il n’existe pas de technique relativement simple de mesure de l’activité de l’HRGP.

* Dosage du TAFI :

Le TAFI antigène est quantifié par la méthode Elisa en sandwich utilisant des anticorps polyclonaux antiprocarboxypeptidase U recombinante.

La détection est faite par un second anticorps conjugué à la phosphatase alcaline.

Ce test spécifique de la pro-CPU ne tient pas compte des différentes formes moléculaires, comme la pro-carboxypeptidase N.

Le taux de TAFI antigène déterminé par cette méthode est parfaitement corrélé à l’activité du TAFI déterminée par une autre méthode fonctionnelle, basée sur les effets du TAFI sur le temps de lyse du caillot.

Les concentrations moyennes de TAFI antigène varient selon les auteurs entre 13,4 et 275 nM.

Le TAFI activé peut être quantifié par une méthode colorimétrique utilisant l’hippuril-Arg, qui libère de l’hippurate par l’action du TAFIa.

L’adsorption est mesurée à 382 nm.

3- Tests indirects :

* Dosage du fibrinogène :

La technique la plus couramment utilisée en raison de sa facilité et de sa rapidité d’exécution est celle de Clauss.

Elle consiste à mesurer le temps de coagulation d’un plasma dilué additionné d’une solution de thrombine concentrée. Le temps de coagulation mesuré est inversement proportionnel à la concentration en fibrinogène.

Les résultats sont influencés en partie par les produits de dégradation du fibrinogène et de la fibrine, qui interfèrent dans la réaction et réduisent le taux apparent du fibrinogène.

Les techniques immunologiques qui sont sensibles aux produits de dégradation de la fibrine peuvent donner des résultats par excès.

Il existe des plasmas de référence calibrés en taux de fibrinogène.

Les valeurs normales sont comprises entre 2 et 4 g/L, correspondant à 6 et 12 µM/L.

L’hypofibrinogénémie acquise est un très bon argument en faveur de sa dégradation in vivo, mais un taux normal de fibrinogène ne doit pas faire écarter un processus fibrinolytique, car une synthèse accrue de fibrinogène peut compenser une dégradation augmentée.

Il est intéressant d’étudier parfois la courbe de polymérisation du fibrinogène, en particulier en cas de dysfibrinogénémie.

Il existe une méthode Elisa capable de doser le fibrinogène « intact » pour le différencier du fibrinogène ayant subi une dégradation partielle.

* Temps de thrombine :

Il est allongé par la présence d’héparine ou de PDF témoins de l’activité fibrinolytique, car ce sont des inhibiteurs de la fibrinoformation.

Ce test est peu sensible et peu spécifique.

C’est la mesure du temps de coagulation d’un plasma citraté après apport d’une quantité faible de thrombine, permettant d’obtenir un tempstémoin voisin de 20 secondes.

Un écart de 2 à 3 secondes entre le temps du patient et celui du témoin est jugé acceptable.

* Temps de reptilase :

La reptilase est une enzyme de venin de serpent non sensible à l’héparine, mais sensible aux produits de dégradation de la fibrine et à l’hypofibrinogénémie.

Le temps de reptilase est pratiqué pour le diagnostic d’un allongement de temps de thrombine.

L’association temps de thrombine/temps de reptilase peut être utile chez les malades recevant la combinaison traitement thrombolytique et héparinothérapie.

Les temps et leurs interprétations sont comparables à ceux du temps de thrombine.

* Dosage des PDF sériques :

Une teneur élevée en PDF dans le sérum témoigne soit d’une activité fibrinolytique circulante liée à une décharge d’activateurs et formation de plasmine en quantité importante, soit d’une fibrinolyse localisée au niveau des thrombi, sans activité fibrinolytique circulante exagérée.

Le dosage des PDF sériques a été remplacé par celui des D-dimères en plasma.

* Dosage des D-dimères :

Les D-dimères peuvent être dosés de manière semi-quantitative, en utilisant le test d’agglutination de particules de latex sensibilisées avec un anticorps monoclonal anti-D-dimère humain (latex-enhanced photometric immunoassay, LPIA).

De même, ils peuvent être dosés de manière quantitative par des techniques immunoenzymatiques (EIA).

L’utilisation d’anticorps monoclonaux permet désormais de rechercher dans le plasma les produits de dégradation du fibrinogène et de la fibrine, et même de les différencier.

La recherche par une technique au latex sur lame précède le dosage immunoenzymologique des D-dimères spécifiques de la dégradation de la fibrine.

Il faut noter que l’absence de préparation de référence standard, à taux de D-dimères connus, diminue la qualité des résultats et rend difficile la comparaison de résultats obtenus avec des méthodes différentes.

Le diagnostic de CIVD est effectué généralement en urgence avec une technique au latex.

En revanche, l’exclusion d’un accident thromboembolique veineux exige l’emploi d’une technique validée pour cet usage.

Les concentrations normales des PDFg, des PDF et des D-dimères sont respectivement inférieures à 250 ng FE/mL, 310 ng FE/mL et 500 ng FE/mL (FE : unité équivalente à celle du fibrinogène intact).

* Dosage de la fibrine soluble :

La recherche de fibrine soluble est désormais possible, et permet d’affirmer le diagnostic des coagulations intravasculaires disséminées (CIVD).

Le dosage peut être réalisé à l’aide d’un coffret de réactif. La méthode utilisée est fondée sur la propriété que possède la fibrine soluble à potentialiser l’activation du plasminogène par le rt-PA.

La plasmine formée est ensuite dosée à l’aide d’un substrat chromogène spécifique.

Il existe depuis peu des méthodes immunologiques plus précises utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques de la fibrine soluble.

Les résultats de ces méthodes ont montré une corrélation entre le taux de fibrine mesuré et la survenue de maladies thromboemboliques. Les valeurs normales sont comprises entre 13 et 105 ng/mL.

B - DÉTECTION DES HYPOFIBRINOLYSES :

Le test qui a été utilisé est la mise en évidence d’une libération dans le sang circulant d’activateurs du plasminogène à partir d’un vaisseau soumis à l’anoxie.

Cette libération se traduit biologiquement par un raccourcissement du temps de lyse des euglobulines.

L’absence ou la diminution de la réponse fibrinolytique après stase veineuse pourrait être le témoin d’une prédisposition à la thrombose.

Cette réponse fibrinolytique est insuffisante pendant le 3e trimestre de la grossesse, chez des malades ayant présenté des thromboses à répétition, et dans la maladie de Behçet.

Cependant, ce test provoqué par stase veineuse peut être perturbé chez un petit nombre de sujets apparemment normaux (5 à 10 % des sujets-témoins).

Un test anormal est souvent lié à un excès de PAI-1. Cette activité inhibitrice peut être évaluée spécifiquement comme indiqué plus haut.

L’injection de DDAVP (D-amino-D-arginine vasopressine) a également été utilisée pour déclencher la libération du t-PA.

Le dosage de l’activateur libéré par les endothéliums vasculaires peut être effectué à partir de la biopsie d’un fragment de veine.

Ce dosage, couplé à l’épreuve précédente, permet de distinguer l’insuffisance de fibrinolyse d’un trouble de libération.

L’intérêt de la recherche d’une hypofibrinolyse est remis en question, et elle est de plus en plus rarement pratiquée.

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