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Hématologie
Système HLA
Cours d'hématologie
 


 

Introduction :

Le système immunogénétique human leucocyte antigen (HLA) fait partie d’un ensemble génétique complexe, noté complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), localisé chez l’homme sur le bras court du chromosome 6 (bande 6p21.3).

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La reconnaissance des premières molécules HLA à partir de 1952 par Dausset, prix Nobel de médecine en 1980, représente le point de départ d’une extraordinaire épopée scientifique et médicale.

Ce système HLA joue, par le biais de nombreuses molécules, un rôle capital dans la réponse immune.

La diversité structurale, ou polymorphisme, de ces nombreuses molécules et leur spécialisation expliquent la diversité fonctionnelle observée et donc les implications cliniques variées de ce système HLA.

Celui-ci contribue largement à la différenciation du soi et du non-soi, d’où son rôle en transplantation d’organes et en greffe de moelle, mais aussi dans le développement d’une réponse à des éléments peptidiques (étrangers ou autologues) immunogènes, et ce dans certaines circonstances.

C’est ainsi que les molécules HLA, selon différents mécanismes, jouent un rôle quelquefois prépondérant de facteur génétique de susceptibilité ou de résistance à de nombreuses maladies.

Enfin, il apparaît plus récemment que ces molécules HLA jouent aussi un rôle dans l’immunosurveillance antitumorale.

Au plan méthodologique, les techniques d’analyse de la diversité HLA et des réponses humorales ou cellulaires à ces molécules HLA atteignent des degrés de résolution et de sensibilité extrêmes en utilisant les outils les plus modernes de la biologie.

Les données obtenues éclairent toujours plus le rôle immunologique majeur de ce système HLA, dont l’équivalent est retrouvé chez tous les vertébrés.

Généralités sur le système :

A - HLA HISTORIQUE :

Dès 1954, la technique, peu sensible, de leucoagglutination sur lame, a permis à Dausset la mise en évidence d’un nouveau système antigène-anticorps de groupes sanguins (groupe leucocytaire).

La publication du premier antigène, désigné MAC, de ce nouveau système fut suivie de l’identification de nombreux autres antigènes par une nouvelle technique sérologique appelée la « lymphocytotoxicité (LCT) complément-dépendante » (1964).

La compréhension de la génétique de ce système complexe, comprenant plusieurs séries alléliques (notamment HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ, -DP) rangées en deux classes principales (classe I et classe II), fut le travail de 30 ans d’efforts collaboratifs internationaux (workshops- HLA) depuis 1965.

À partir du milieu des années 1980, l’avènement et la maîtrise progressive des techniques de biologie moléculaire du gène, ainsi que la parfaite définition des structures moléculaires ont permis une meilleure compréhension fonctionnelle de ce système.

 B - CARTOGRAPHIE :

Les premières cartes chromosomiques du CMH de l’homme ont bénéficié des travaux faits chez la souris (système H-2), de l’observation de familles informatives avec recombinaisons chromosomiques, d’étude de populations, de techniques de cultures de cellules de mammifères (technique des hybrides cellulaires somatiques).

Ainsi furent précisées les notions génétiques essentielles propres à ce système : localisation sur le bras court du chromosome 6 chez l’homme (bande 6p21.3), et ordre des principaux gènes HLA du télomère vers le centromère (HLA-A,-C, -B, -DR, -DQ et -DP).

Les méthodes plus fines de la biologie moléculaire moderne ont conduit à des cartes toujours plus détaillées de cette région de 4 000 kb correspondant au CMH de l’homme. Schématiquement, ce CMH comporte trois régions riches en gènes.

Celles-ci sont notées, du télomère vers le centromère, région de classe I (abritant notamment les gènes HLA dits « classiques » de classe I : HLA-A, -B et -C) s’étirant sur quelque 2 000 kb ; région de classe III (abritant des gènes apparentés ou non HLA, mais dont un grand nombre est impliqué dans la réponse immune, tels les gènes codant certaines protéines du complément C2, C4, Bf, ou certaines cytokines) couvrant une longueur de 1 000 kb ; enfin, la région de classe II (abritant des gènes DR, DQ et DP) sur une longueur de 1 000 kb.

La première séquence complète et la carte génique du CMH de l’homme ont été récemment publiées (1999).

Au total, 224 gènes ont été identifiés, mais seulement 128 seraient exprimés. Une fonction immunitaire est attribuée à 40 % de ces gènes exprimés.

C - NOMENCLATURE :

Devant l’accumulation des données et en raison de la diversité (polymorphisme) de ce système, un comité de nomenclature internationale définit régulièrement des règles strictes d’écriture.

Celles-ci permettent de référencer clairement les régions géniques (loci), les allèles (ou gènes), les produits (ou antigènes) HLA propres à ce CMH.

Des équivalences avec d’anciennes désignations sont également précisées.

D’une façon générale, chaque spécificité moléculaire HLA est désignée par une lettre précisant le locus auquel elle appartient (HLA-A pour locus A) suivie par son numéro spécifique (par exemple HLA-alpha2, HLA-bêta27).

Pour le locus C, et afin d’éviter toute ambiguïté avec les protéines du complément, la lettre « w » (pour workshop) est accolée à C (par exemple HLA-Cw2).

Il est également encore d’usage de mentionner, pour certains antigènes, la spécificité « large » (broad) à laquelle elle appartient sérologiquement.

Ainsi, les deux spécificités antigéniques alpha25 et alpha26 furent officiellement reconnues en 1972 comme une subdivision de la spécificité « broad » alpha10, identifiée depuis 1970.

Cette information est alors précisée de la façon suivante : alpha25(10) ou alpha26(10).

Ceci est le cas de nombreuses autres spécificités à chaque locus.

On distingue la nomenclature des antigènes (définis par sérologie et/ou technique cellulaire), qui répond aux règles ci-dessus, de celle des gènes (allèles) codant ces produits antigéniques.

Dans cette dernière, un allèle est référencé par le locus auquel il appartient suivi d’un astérisque (*), puis de deux chiffres (incluant le 0 quand nécessaire), pour désigner la spécificité allélique (par exemple HLA-A*03, HLAB* 35).

Ces deux premiers chiffres sont identiques, sauf rares exceptions, à la spécificité antigénique correspondante.

Enfin, pour préciser encore le variant allélique d’un allèle donné, deux chiffres supplémentaires sont utilisés (par exemple HLA-B*2705).

D - PARTICULARITÉS DE CE SYSTÈME :

Plusieurs caractéristiques rendent ce système de groupes remarquable.

La diversité (ou polymorphisme) qui porte sur le nombre de séries (ou locus) et pour chaque série sur le nombre de marqueurs spécifiques est la plus exemplaire.

Ainsi, au minimum, six séries alléliques HLA (-A, -B, -C, -DR, -DQ, -DP) et 800 marqueurs sont individualisés, qui pourraient conduire à rendre unique, en théorie et en dehors des situations familiales, chaque être humain.

Chaque individu héritant, à chaque série, de deux gènes (l’un du père, l’autre de la mère), le nombre de combinaisons possibles dépasse les 10 milliards !

La réalité est quelque peu différente.

Ainsi, dans une population géographique donnée, les fréquences des marqueurs HLA peuvent être très variables.

Chez les Caucasoïdes, le gène HLA-A*02 est présent chez environ 21,5 % des sujets de la population, contre seulement 0,8 % pour le gène HLAA* 34 dans cette même population.

D’autre part, pour un même gène HLA-A*11, par exemple, la fréquence varie de plus de 30 % en Thaïlande à moins de 0,5 % chez les sujets noirs d’Afrique.

Un autre point caractéristique est lié à la proximité de ces loci dans une même région chromosomique de 4 Mb (4 000 kb).

Ce fragment chromosomique, haplotype, est transmis en bloc à la descendance.

Chaque individu se caractérise ainsi par deux haplotypes HLA, provenant l’un du père et l’autre de la mère.

Ces deux haplotypes définissent le génotype de l’individu.

Exemple de génotype (A, B, DR, DQ) et convention d’écriture : HLA-A2, B44, DR1, DQ5/alpha30, B44, DR4, DQ7 ou encore :

(A2 - B44 - DR1 - DQ5)/(A30 - B44 - DR4 - DQ7)=(haplotype a)/(haplotype b)=a/b

L’expression codominante de tous ces gènes permet l’identification des molécules correspondantes et l’établissement d’un groupage HLA ou phénotype HLA, noté ainsi : HLA-alpha2, 30 ; B44 ; DR1, 4 ; DQ5, 7

Ce phénotype fait apparaître une hétérozygotie aux loci A, DR et DQ et une homozygotie B44 au locus B, puisqu’une seule spécificité est identifiée.

Seule l’étude familiale et le génotype qui en est déduit permettent d’affirmer cette homozygotie.

La transmission en « bloc » des haplotypes connaît de rares exceptions dues, lors des méioses, à des recombinaisons chromosomiques ou crossing-over entre loci, de fréquences variables mais d’autant plus élevées que les loci concernés sont éloignés.

La fréquence de cette recombinaison entre les deux chromosomes 6 (du père ou de la mère) est de l’ordre de 0,8 % entre les loci HLA-A et -B et conduit à l’apparition d’un nouvel haplotype dit « recombinant ».

Ce taux de « recombinants » observés a longtemps représenté une unité de mesure de distance génique (exprimée en centimorgans [cM]) entre loci.

Enfin, une dernière particularité génétique de ce système, due à plusieurs causes possibles (effet fondateur, sélection au cours de pandémies…), se traduit par la surabondance de certaines combinaisons d’allèles de plusieurs loci conduisant à l’enrichissement d’un haplotype donné dans une population.

Ainsi, l’haplotype alpha1-B8 est observé dans les populations européennes de l’Ouest avec une fréquence de 0,0672, alors que le calcul théorique, prenant en compte les fréquences de ces deux allèles, donne une valeur attendue de 0,0136, correspondant au produit des fréquences alpha1 et B8 (alpha1 = 0,142 X B8 = 0,096).

La différence (ou D) est appelée « déséquilibre de liaison » (linkage).

Ces fréquences (géniques et haplotypiques) varient selon les groupes ethniques considérés et sont régulièrement réévaluées dans le cadre d’études collaboratives internationales (workshop-HLA).

Le plus souvent, le déséquilibre de liaison est positif, avec un excédent d’haplotypes observés.

Il peut être négatif lorsque l’haplotype considéré et observé est en défaut par rapport au calcul théorique.

Ces déséquilibres de liaison peuvent porter sur l’haplotype complet, entre deux loci extrêmes comme HLA-A et -DP.

Dans la partie Ouest de la France, l’haplotype associant alpha29, B44(12), DR7, DQ2 et DP11 en constitue un exemple.

E - TRANSMISSION GÉNÉTIQUE :

Les gènes HLA sont donc transmis génétiquement en bloc, par haplotypes entiers, des parents aux enfants.

Chacun de ces gènes est autosomique dominant.

Dans un couple, les deux haplotypes paternels (a, b) et les deux haplotypes maternels (c, d) peuvent se conjuguer en donnant quatre combinaisons haplotypiques différentes de fréquences statistiques identiques, soit 25 % (ac = ad = bc = bd = 0,25).

Le cinquième enfant correspond à un sujet recombinant, avec un haplotype nouveau (noté c/d) d’origine maternelle.

Structure biochimique des molécules et gènes HLA :

Les molécules exprimées à la surface cellulaire sont regroupées en deux classes principales (dites classe I et classe II).

Celles-ci correspondent à des différences de structures.

A - MOLÉCULES ET GÈNES HLA DE CLASSE I :

Des caractéristiques biochimiques et fonctionnelles permettent d’individualiser deux groupes distincts de protéines codées par une famille mutigénique de 17 séquences apparentées.

1- Molécules et gènes HLA de classe I dits « classiques » :

Ces gènes HLA-A, -B, et -C codent la chaîne lourde (a) des molécules de classe I (44 kDa), associée de manière non covalente, à la surface de la quasi-totalité des cellules, à la bêta2 microglobuline (bêta2m), chaîne dite « légère » de 11,5 kDa.

La chaîne lourde a compte une partie intracytoplasmique, une partie transmembranaire et une partie extracellulaire composée de trois domaines (alphalpha1, alpha2 et alpha3).

La structure tridimensionnelle de ce type de molécules HLA de classe I classiques est connue depuis 1987 et explique le rôle fonctionnel de ces molécules dans la présentation de peptides aux lymphocytes T.

Les gènes de classe I classiques se composent de huit parties codantes (exons) séparées par sept introns non codants.

L’exon 1 correspond à la région 5’ non traduite et au peptide signal, l’exon 8 correspond pour partie à la région 3’ non traduite, les exons 2, 3, 4, 5, 6, 7 et une partie de l’exon 8 codent chacun une séquence de la chaîne lourde, respectivement de l’extrémité NH2 distale alphalpha1 à la partie intracytoplasmique carboxylique proximale.

Ces gènes, et donc les molécules correspondantes, sont extrêmement polymorphes pour chacune des trois séries alléliques -A, -B et -C.

On dénombre ainsi respectivement plus de 120, 250 et 70 séquences nucléotidiques différentes (allèles) pour ces trois séries.

Ce polymorphisme de séquence est concentré dans trois zones, dites « hypervariables », localisées dans les exons 2 et 3 et donc dans les parties correspondantes distales alpha1 et alpha2 de la molécule.

2- Molécules et gènes HLA de classe I dits « non classiques » :

Les gènes HLA-E, -F et -G, identifiés à la fin des années 1980, codent des structures moléculaires très proches des précédentes.

La distribution tissulaire restreinte, la régulation d’expression différente et le polymorphisme beaucoup plus limité les différencient des molécules classiques.

L’architecture de ces molécules également associées à la bêta2m est pourtant identique.

Au plan fonctionnel, il n’est pas exclu que certaines molécules puissent présenter des antigènes.

Néanmoins, quelques modifications dans la structure des gènes E, F et G conduisent à quelques différences structurales, dont un raccourcissement plus ou moins important de la partie intracytoplasmique de ces trois molécules.

De plus, l’existence possible d’épissages alternatifs d’un ou deux exons conduit à la transcription de plusieurs isoformes différentes. Ainsi, cinq isoformes membranaires ou solubles sont possibles pour HLA-G.

3- Molécules et gènes HLA apparentés aux classes I :

Les gènes MIC identifiés au voisinage du locus B présentent une homologie de séquence de 20 à 30 % avec les gènes de classe I classiques.

Seuls deux, MICA et MICB, sont exprimés, avec une distribution cellulaire limitée (cellules épithéliales) et un polymorphisme assez élevé.

MICA ne s’associe pas à la bêta2m et peut s’exprimer en l’absence de fixation de peptide.

Plus récemment (1996), un gène candidat de l’hémochromatose, noté HFE (et non HLA-H comme initialement proposé), a été localisé à plus de 4 Mb de la région HLA, en position télomérique par rapport à HLA-A.

Ce gène code une chaîne lourde homologue à celle des molécules de classe I, qui s’associe à la bêta2m.

Ce gène joue un rôle prépondérant dans la régulation d’absorption du fer. Deux mutations principales de ce gène, et donc de la molécule correspondante (dont C282Y), sont associées à 70 à 90 % des cas d’hémochromatose.

Il est intéressant de noter que la mutation C282Y abolit la liaison de la chaîne lourde avec la bêta2m, réduisant probablement la capacité de fixation de cette protéine HFE au récepteur de la transferrine.

C - MOLÉCULES ET GÈNES HLA DE CLASSE II :

Au plan structural, les molécules de classe II sont, comme les molécules de classe I, des hétérodimères faits de deux chaînes protéiques notées a et b.

Ces deux chaînes sont codées par des gènes HLA différents (A et B) situés dans la région dite « de classe II ».

Il n’existe donc pas d’association avec la bêta2m.

1- Molécules et gènes HLA de classe II dits « classiques » :

Ces molécules appartiennent aux trois séries notées HLA-DR, -DQ et -DP.

Ainsi l’on distingue les molécules DR, DQ et DP constituées de deux chaînes (a et b), codées par les gènes correspondants notés DRA et DRB, DQA et DQB, DPA et DPB.

La structure tridimensionnelle d’une molécule HLA-DR1, déterminée par cristallographie et diffraction aux rayons X, est similaire à celle d’une molécule de classe I.

Au niveau génomique, la réalité est un peu plus complexe car il existe, en raison de duplication génique, de nombreux gènes ne codant pas (pseudogènes) ou codant des chaînes b supplémentaires dans le cas de certains haplotypes, particulièrement dans la sous-région DR.

Ainsi, selon les individus, on distingue, au niveau de l’expression membranaire, plusieurs molécules de classe II possibles :

– molécules DR (DRB1, DRB3 ou DRB4 ou DRB5) : elles correspondent à l’expression des gènes DRA (codant une chaîne a quasiment invariable), DRB1 (gène très polymorphe), et dans certains cas à l’expression des gènes, DRB3, ou DRB4, ou DRB5 (chacun codant une chaîne b plus ou moins polymorphe, capable de s’associer à la chaîne DRa) ;

– molécules DQ : elles correspondent à l’expression des gènes DQalpha1 et DQB1 des deux haplotypes ;

– molécules DP : elles correspondent à l’expression des gènes DPalpha1 et DPB1 des deux haplotypes.

Les gènes DQalpha2, DQbêta2, DQB3 et DPalpha2, DPbêta2 sont des pseudogènes, sans produits d’expression.

Cette pluralité moléculaire est le fruit de combinaison de chaînes (a et b) synthétisées par des gènes portés par le même haplotype (molécules normales dites « de ciscomplémentation »).

Cependant, des molécules dites « hybrides », fruits de l’association de chaînes (a et b) synthétisées par des gènes portés par les deux haplotypes (molécules hybrides de transcomplémentation), ont été rapportées chez la souris, puis chez l’homme.

Ces molécules hybrides ajoutent encore plus de diversité HLA et pourraient expliquer d’une part la susceptibilité accrue de certains sujets (hétérozygotes) à certaines maladies comme le diabète, et d’autre part l’avantage sélectif des sujets hétérozygotes HLA, hypothèse proposée dès 1975 et confirmée à partir de 1991.

2- Molécules et gènes HLA apparentés aux classes II :

Deux molécules HLA-DO et HLA-DM, complémentaires dans leur fonction et répondant à une structure protéique hétérodimérique sont également codées par des gènes HLA de classe II, respectivement DOA (anciennement noté DNA) et DOB d’une part, DMA et DMB d’autre part.

Ces deux structures moléculaires DO et DM ne sont pas exprimées à la surface cellulaire mais à la membrane des compartiments endosomiques intracellulaires.

Elles interviennent toutes deux dans la présentation des peptides par les molécules HLA de classe II classiques, dont elles partagent environ 25 % d’homologie de séquences.

HLA-DM participe indirectement à la sélection des peptides présentés, et HLA-DO régule l’activité de HLA-DM.

Expression tissulaire, régulation d’expression et molécules HLA solubles :

A - EXPRESSION TISSULAIRE :

1- Molécules de classe I classiques (HLA-A, -B, -C) :

Ces molécules sont exprimées sur la quasi-totalité des cellules nucléées de l’organisme.

Néanmoins, des variations quantitatives sont notables. Les cellules lymphoïdes, les lymphocytes T et B, les cellules dendritiques, les macrophages sont parmi les plus riches en molécules de classe I, ainsi que les épithéliums et les endothéliums vasculaires.

Certains tissus expriment peu ces molécules (thyroïde, pancréas, muscle cardiaque) ou de manière indétectable (cornée, neurones) ou très variable (hépatocytes).

Les globules rouges matures n’expriment pas de molécules HLA de classe I ou seulement de très faibles quantités de certaines spécificités (HLA-alpha28, -B7 et B17).

Les réticulocytes sont HLA de classe I positifs.

Les plaquettes sanguines sont riches en molécules de classe I probablement adsorbées à partir du plasma, puisque l’on trouve des molécules HLA solubles dans le plasma.

D’une façon générale, les molécules HLA-C sont quantitativement moins exprimées que les produits HLA-A et -B.

2- Molécules HLA-E, -F, -G :

Les gènes codant ces produits sont transcrits en faible quantité, et les produits correspondants ne sont pas toujours exprimés ou détectables à la surface cellulaire.

HLA-G est bien exprimé par les cellules du cytotrophoblaste extravilleux mais pourrait l’être aussi par d’autres tissus.

Pour HLA-E et -F, de faibles quantités de protéines peuvent être détectées dans le cytoplasme.

Dans le cas particulier d’HLA-E, le chargement en peptides particuliers (issus de molécules de classe I classiques) permettrait son expression à la surface cellulaire.

Cette expression d’HLA-E protégerait la cellule d’une lyse par des cellules natural killers (NK).

3- Molécules HLA de classe II :

Ces molécules sont exprimées de manière plus restreinte que celles de classe I.

Elles sont décelables principalement à la surface des lymphocytes B et des cellules monocytaires, macrophagiques et dendritiques qui sont toutes des cellules capables de présenter des peptides antigéniques aux lymphocytes T (cellules présentatrices de l’antigène ou CPA).

Les précurseurs hématopoïétiques des globules rouges et des granulocytes sont de classe II positifs, puis se négativent.

Certains tissus sont également riches en molécules HLA de classe II (endothéliums vasculaires, glomérules rénaux…).

Enfin, il est admis que ce sont les molécules DR qui sont le plus représentées à la surface cellulaire par rapport aux molécules DQ et DP.

4- Modulation de l’expression tissulaire :

Cette expression cellulaire naturelle des molécules HLA de classes I et II peut être grandement modulée par les interférons ou d’autres cytokines de la réaction inflammatoire.

Les interférons augmentent significativement l’expression des molécules de classe I, ainsi que le tumor necrosis factor (TNF)a.

Ces facteurs peuvent aussi agir sur des cellules de classe II négatives pour leur permettre une expression de classe II.

B - RÉGULATION D’EXPRESSION, DÉFAUTS D’EXPRESSION ET DÉFICITS IMMUNITAIRES :

Les mécanismes de régulation d’expression et de transcription des gènes sont communs aux deux classes I et II et font intervenir à la fois des séquences régulatrices en amont des gènes de structures et des protéines spécifiques dont l’interaction conduit à la régulation de la transcription des gènes.

Quelques polymorphismes de séquence dans ces régions promotrices de la transcription de gènes HLA expliquent certains défauts d’expression de molécules HLA.

Le défaut d’expression peut, selon l’étiologie, concerner l’ensemble des antigènes de classe I ou II, ou encore un antigène de classe I ou II isolément.

Les causes de non-expression sont diverses et peuvent aussi être le fait d’autres gènes dont les produits sont indispensables à la conformation tridimensionnelle de la molécule ou codant des facteurs contrôlant la transcription des gènes HLA.

Ainsi l’on peut distinguer plusieurs situations.

1- Non-expression ou faible expression des molécules HLA de classe I :

* Absence de transporteurs de peptides ou TAP :

Six cas ont été décrits où l’absence d’expression de l’ensemble des molécules de classe I est due à un défaut des gènes TAP1 ou TAP2 codant le transporteur de peptides TAP.

La transmission est récessive, les patients issus de mariages consanguins présentant le défaut de manière homozygote.

Le transporteur des peptides n’étant pas fonctionnel, les peptides du cytosol ne peuvent entrer dans le réticulum endoplasmique ni être chargés par les molécules de classe I.

Celles-ci n’ont pas alors la structure tridimensionnelle attendue, restent bloquées entre le réticulum endoplasmique et le cis-Golgi, et seules 1 à 3% des molécules de classe I chargées par des peptides indépendants du transporteur de peptides sont exprimées à la surface cellulaire.

Le tableau clinique est évocateur : les patients, sains pendant les premières années de leur vie, souffrent à la fin de l’enfance d’infections bactériennes pulmonaires très sévères rappelant la mucoviscidose.

Certains présentent en plus des ulcères cutanés.

Ces patients ont néanmoins une synthèse d’anticorps antiviraux et antibactériens normaux et des lymphocytes T-CD8 sont présents, bien que leur nombre absolu soit diminué.

* Absence d’un facteur non défini à ce jour :

Trois cas ont été décrits dans lesquels un défaut de transcription réduisait de dix fois le nombre de l’ensemble des molécules HLA de classe I.

Le défaut génétique et le mode de transmission ne sont pas connus.

Cependant, le gène n’est pas présent sur le chromosome 6 puisque les membres de la fratrie atteints ne sont pas HLA-identiques.

Les individus porteurs de ce défaut sont sains et la découverte du déficit est fortuite.

* Allèles nuls de classe I :

La non-expression d’un seul allèle HLA de classe I chez un individu, alors que l’expression des autres allèles de classe I est normale, est la conséquence d’un défaut du gène HLA portant cet allèle.

Ces allèles sont notés dans la nomenclature officielle par la lettre « N » (nul).

Ils peuvent résulter :

– d’une substitution d’un nucléotide, dans un exon générant un codon stop (A*0215N, A*0232N, A*2409N, B*1526N) ;

– d’un décalage du cadre de lecture consécutif à une délétion de nucléotide(s) dans un exon ou un intron (A*0105N, A*6811N, B*0808N, N*1501102N), ou consécutif à une insertion de nucléotide(s) (A*0104N, A*2411N, A*2611N, B*5111N) ;

– de la délétion d’un codon impliqué dans un pont disulfure (A*0303N).

Les individus présentant ces allèles nuls sont sains. Ils sont à considérer comme ne portant pas l’antigène en question.

* Allèles faiblement exprimés de classe I :

La faible expression d’un allèle HLA de classe I isolé chez un individu alors que l’expression des autres allèles HLA de classe I est normale, est la conséquence d’une mutation sur le gène HLA portant cet allèle.

Ceci est le cas d’un allèle HLA-A*02 présentant une substitution dans la région promotrice du gène et d’un allèle A*2402, où une substitution dans l’intron 2 amène à un épissage anormal.

Les individus présentant ces allèles sont sains et sont à considérer comme portant l’antigène en question.

2- Non-expression des molécules HLA de classe II :

* Défaut de régulation de la transcription des gènes de classe II :

Environ 70 malades ont été décrits présentant un défaut d’expression de l’ensemble des molécules HLA de classe II (DR, DQ, DP, DM) et de la chaîne invariante Ii (CD74).

Contrairement aux déficits d’expression de classe I, c’est le tableau clinique alarmant qui oriente vers le diagnostic (infections gravissimes dès les premiers mois de la vie à type de septicémies, infections gastro-intestinales, pulmonaires et urinaires récurrentes qui évoluent inexorablement vers la mort).

La majorité des patients ont une agammaglobulinémie et une diminution du nombre absolu des lymphocytes CD4+.

La transmission familiale est récessive et n’est pas liée au chromosome 6, les patients d’une même famille étant HLA différents. Bien que le tableau clinique soit homogène, l’étiologie ne l’est pas.

* Allèles nuls de classe II :

Comme pour la classe I, la non-expression d’allèles HLA de classe II isolés a été notée.

Le nombre d’allèles de classe II nuls est moins important que pour la classe I et il s’agit d’allèles codés par les gènes DRB4, DRB5 et DPB1.

C - MOLÉCULES HLA SOLUBLES :

La présence de molécules HLA solubles autologues a été signalée dès 1970 dans la fraction des bêtalipoprotéines du sérum d’individus normaux.

Sa source est triple : relargage des molécules exprimées à la surface cellulaire, épissage anormal (sans partie transmembranaire) et sécrétion d’une forme soluble (sans partie transmembranaire et intracytoplasmique).

La quantité d’antigènes solubles est corrélée au phénotype HLA de l’individu.

Ainsi, les individus HLA-alpha23, -alpha24, -alpha29 et -alpha33 ont des quantités de substances solubles plus importantes que les individus ne portant pas ces antigènes.

À l’inverse, HLA-alpha2 serait associé à une faible sécrétion.

Les substances solubles de classe I ou II trouvées dans le sérum sont aussi présentes dans d’autres sécrétions de l’individu (urine, sueurs, larmes...).

En pathologie, leur présence est augmentée dans les infections et les maladies inflammatoires mais diminuée dans les cancers.

Après transplantation d’organes, des molécules HLA solubles du donneur sont rapidement détectées chez beaucoup de receveurs.

Le rôle de ces molécules dans la régulation immune et la tolérogenèse est confirmé.

Cependant, selon la source des molécules solubles (relarguées ou sécrétées), leurs fonctions pourraient être opposées (antigéniques pour les premières, tolérogènes pour les secondes).

Méthodes d’identification du polymorphisme :

Schématiquement, deux approches d’identification de ce polymorphisme HLA sont possibles.

La première consiste à identifier les molécules à la surface des cellules qui les expriment dans des tests qui utiliseront ces cellules comme support de l’antigène.

En pratique, ces techniques sont dites sérologiques, cellulaires ou biochimiques.

La deuxième approche, plus récente (milieu des années 1980), consiste à identifier les gènes HLA au niveau de l’acide désoxyribonucléique (ADN) génomique des cellules.

Ces techniques sont dites de biologie moléculaire des gènes HLA ou techniques ADN, et permettent la description d’un polymorphisme quantitativement plus important.

A - IDENTIFICATION DU POLYMORPHISME DES PRODUITS HLA EXPRIMÉS :

1- Techniques sérologiques :

À la technique princeps de leucoagglutination utilisée à la fin des années 1950, a succédé la technique de micro-LCT, publiée par Terasaki et McClelland en 1964.

C’est la technique de référence, dite « LCT complément-dépendante ».

Elle nécessite des cellules lymphocytaires viables, isolées le plus souvent du sang périphérique par séparation sur gradient de densité (Ficoll).

Cette population de lymphocytes (Ly) totaux peut être utilisée telle quelle après ajustement en concentration cellulaire pour des typages HLA de classe I.

Pour des typages HLA de classe II, une séparation des Ly T et des Ly B est nécessaire et seule cette dernière population est utilisée.

Ces cellules sont utilisées réparties dans les puits de microplaques contenant chacun un anticorps anti-HLA de spécificité connue (ou quelquefois un mélange limité de spécificités).

Ces anticorps sont des réactifs de typages sélectionnés, issus du sérum de sujets allo-immunisés (grossesses, transfusions ou greffes).

Ces anticorps sont rarement monospécifiques et plus souvent des mélanges.

De plus, du fait des modalités de la génération du polymorphisme HLA, un anticorps peut reconnaître plusieurs spécificités HLA porteuses d’un même enchaînement d’acides aminés (épitopes).

Plus récemment, sont utilisés des anticorps monoclonaux polymorphiques, qui présentent l’avantage d’être constants en réactivité et spécificité.

Ces réactions sérologiques cellules-sérums (ou antigène-anticorps) sont visualisées, après addition de complément de lapin (titré et sélectionné), par la lyse ou non des Ly et l’incorporation en cas de lyse d’un colorant vital (bleu trypan, éosine…) ajouté en fin de réaction.

La complexité de l’interprétation est liée à de nombreux paramètres (richesse et viabilité cellulaires, disponibilité et qualité des anticorps, réactions croisées entre épitopes…).

Elle est plus délicate encore pour un typage HLA de classe II.

Ces techniques restent des actes réservés de biologie médicale.

2- Techniques biochimiques :

Elles ne sont pas utilisées en routine pour les typages HLA.

L’isoélectrofocalisation (IEF) nécessite un typage sérologique préalable HLA de classe I.

Elle a permis de définir des variants non détectables sérologiquement, par les différences de charges électriques d’acides aminés, objets de mutation.

De même, pour les antigènes HLA de classe II, en particulier DR et DQ, un radiomarquage, une précipitation par des anticorps monoclonaux sélectionnés et une électrophorèse bidimensionnelle ont permis d’identifier un polymorphisme lié à la fois au poids moléculaire et à la charge de ces molécules.

Néanmoins, ces techniques lourdes à mettre en oeuvre sont longues et difficiles à standardiser et ne peuvent pas être considérées comme de véritables techniques de typage et d’identification du polymorphisme HLA.

3- Techniques cellulaires :

La découverte de la région de classe II et de ses marqueurs, notés dans un premier temps HLA « D », est le fait d’une technique cellulaire : la culture mixte lymphocytaire (ou MLC) (1964).

L’intensité de la réaction de prolifération cellulaire observée lors de la culture in vitro d’un mélange de populations lymphocytaires, issues de deux sujets non apparentés, est fonction de leur disparité HLA de classe II.

De nombreux travaux collaboratifs ont permis de standardiser, sur la base de la technique de culture mixte lymphocytaire, une méthode de typage cellulaire de classe II, réservée à quelques applications cliniques ou travaux de recherche.

Encore faut-il préciser que le typage de classe II obtenu traduit un ensemble de disparités pour les marqueurs DR-DQ principalement et DP accessoirement.

De ce fait, il fut noté « typage de la région “D” », avec une nomenclature spécifique de marqueurs HLA-Dw qui n’est plus utilisée aujourd’hui.

Lors de cultures mixtes positives (prolifération) en raison des disparités des marqueurs de classe II entre les deux populations cellulaires, il peut être noté, en cas de disparités additionnelles des marqueurs de classe I, la production de cellules T cytotoxiques.

Ces clones T de cellules ont pu être utilisés dans des tests cellulaires complexes dits « de cytotoxicité à médiation cellulaire » (CML). Ces tests ont permis d’identifier des variants de spécificités de classe I, comme par exemple pour HLA-alpha2 ou HLA-bêta27.

De ces techniques d’identification des molécules HLA, seules les techniques sérologiques de cytotoxicité complément-dépendante sont utilisées en routine.

Néanmoins, leur niveau de discrimination entre antigènes, la nécessité de disposer de sérums anti-HLA et de cellules viables en quantité suffisante, expliquent le recours fréquent aux techniques de typage par biologie moléculaire des gènes.

B - IDENTIFICATION DU POLYMORPHISME DES GÈNES HLA :

1- Historique : approche « restriction fragment length polymorphism »

Le clonage intensif et progressif des gènes HLA de classe I (1980) et de classe II (1982) a permis l’obtention de clones d’ADN complémentaires et génomiques pour l’utilisation secondaire de sondes HLA.

Celles-ci ont pu être utilisées dans des réactions d’hybridation avec des ADN génomiques à étudier, permettant une étude de polymorphisme de loci ou d’allèles.

Ces premières techniques de typage HLA par biologie moléculaire ADN étaient basées sur l’analyse du nombre et de la taille de fragments d’ADN hybridés à la sonde spécifique HLA, après coupure (digestion) enzymatique sélective de l’ADN cellulaire.

Cette technique dite restriction fragment length polymorphism (RFLP) ou polymorphisme de longueur des fragments de restriction, utilise la méthode de transfert sur membrane.

Son application au typage HLA fut l’objet principal du workshop-HLA 1987 (Princeton, New York) et permit des progrès importants, notamment dans la définition et l’étude du polymorphisme de classe II, appliquées à la compatibilité HLA en transplantation d’organes.

Cette technique RFLP fut aussi la première à permettre une identification du polymorphisme HLA-DP sans le recours à des techniques cellulaires et une mesure de l’impact des incompatibilités DP dans la culture mixte lymphocytaire.

Elle a permis aussi une réévaluation de bon nombre d’associations HLAmaladies, précisant même les données comme dans le cas de l’immunisation antiplaquettaire foetomaternelle.

Cette technique de typage HLA est aujourd’hui abandonnée, en raison de ses obstacles techniques (radioactivité et durée) et de ses limites d’informativité et de précision du polymorphisme.

2- Technique par réaction d’amplification en chaîne :

L’introduction et la publication d’une technique d’amplification génique délimitée ou réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction [PCR]) a révolutionné toutes les approches d’étude de gènes, du clonage au séquençage, en passant par l’étude du polymorphisme.

Cette technique PCR a augmenté la sensibilité, la spécificité et la simplicité des méthodes d’étude des gènes.

Elle implique la succession de cycles (une trentaine en général) comportant chacun trois étapes :

– dénaturation de l’ADN double brin à tester en ADN monobrin à 94 °C ;

– accolement des amorces ou primers, spécifiquement sélectionnées et délimitant la zone génique à amplifier ;

– extension à partir de ces amorces, c’est-à-dire copiage du brin matrice par action de l’enzyme Taq-polymérase thermostable avec incorporation progressive mais rapide des nucléotides mis en excès dans le milieu réactionnel.

Au total, après 30 cycles, l’augmentation exponentielle du nombre de copies conduit à l’obtention d’environ 1 x 106 copies de gènes.

Selon le positionnement des amorces, la séquence amplifiée peut être très spécifique ou non.

Ainsi, on définit habituellement deux types d’amplifications :

– la PCR dite « générique » : les deux primers de délimitation de zone à amplifier sont positionnés dans des zones conservées non polymorphes ;

– la PCR dite « spécifique » : l’une des amorces (voire les deux) est sélectionnée quant à sa zone de complémentarité de séquence pour ne s’hybrider qu’avec une séquence déterminée spécifique d’un allèle ou d’un groupe d’allèles (PCR spécifique d’allèle ou PCR « spécifique de séquence » [PCR-SSP]).

On comprend tout l’intérêt de cette technique PCR dès lors que sont connues les séquences des différents allèles à évaluer.

La sélection des amorces permet l’amplification d’un fragment d’un gène qui est identifié dans un second temps.

À ces variantes opératoires portant sur l’amplification elle-même, s’ajoutent des variantes portant sur l’identification du produit d’amplification.

Ainsi, on distingue au moins trois groupes de méthodes utilisant :

– des oligosondes spécifiques d’allèles ou de séquences (PCR-SSO) marquées radioactivement ou par des enzymes ;

– la digestion du fragment d’amplification : PCR-RFLP ;

– l’électrophorèse pour révéler la présence ou l’absence de produits d’amplification des réactions de PCR-SSP.

Ces techniques de PCR ont permis de remarquables progrès dans l’identification du polymorphisme des gènes HLA de classe II et ont conduit à la mise en évidence d’une extrême diversité allélique, notamment pour DRB1 et DPB1.

Le polymorphisme de classe I reste plus difficile à identifier par ces techniques PCR en raison de la richesse en pseudogènes coamplifiables dans cette région classe I et de la répartition dans deux, voire trois exons, de ce polymorphisme de séquences.

Les techniques PCR sont désormais utilisées en routine dans les laboratoires d’histocompatibilité.

Elles nécessitent une parfaite connaissance de l’immunogénétique HLA et de sa nomenclature pour une interprétation rigoureuse des résultats obtenus.

La précision des typages alléliques (quatre digits) est indispensable dans la sélection de donneurs de moelle non apparentés.

Ces techniques de PCR-SSP ou PCR-SSO ne permettent pas toujours une telle précision, du fait de certaines combinaisons d’allèles pour les deux haplotypes.

Ces ambiguïtés de typages alléliques dues à l’étendue et à la nature du polymorphisme ne peuvent alors être résolues que par une technique de séquençage d’allèles.

3- Séquençage :

Le séquençage de gènes donne les informations les plus précises dans son application au typage HLA.

Basée sur l’analyse par séquençage d’un fragment de gène amplifié par PCR, la technique dite sequencing based typing (PCR-SBT) utilise également un logiciel pour comparaison de la séquence étudiée à celles déjà connues.

Cette technique peut être réalisée rapidement, à l’unité, en moins de 48 heures, et donne des résultats sans équivoque si le produit amplifié est pur de toute contamination par coamplification.

Le choix des amorces d’amplification est en effet primordial.

Le séquençage permet de résoudre les difficultés de typage (ambiguïtés) rencontrées avec la technique PCR-SSP chez des sujets hétérozygotes porteurs de deux allèles de séquences voisines.

Sur un plan technique, cette technique reste basée sur la synthèse enzymatique de fragments d’ADN. Le terme PCR-SBT regroupe des approches méthodologiques variées.

Les différences portent sur le matériel biologique utilisé (ADN génomique, acide ribonucléique messager [ARNm]), sur la stratégie d’amplification, sur les gènes (classe I ou classe II) et les régions (deux ou plusieurs exons) amplifiés, et enfin sur la méthodologie (manuelle ou automatique).

Actuellement, plusieurs stratégies automatisées existent qui utilisent des réactifs de séquençage et des marquages fluorescents différents.

La technique PCR-SBT, recommandée dans la sélection HLA définitive de donneurs de moelle apparentés, est appliquée aussi bien aux gènes HLA de classe I qu’aux gènes de classe II.

Elle permet également d’identifier de nouvelles séquences alléliques qui sont par la suite référencées, et devrait également être utile dans la compréhension de certaines associations HLA-maladie, en précisant les séquences nucléotidiques impliquées.

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