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Hématologie
Mutations et polymorphismes génétiques associés aux thromboses
Cours d'hématologie
 


 

Introduction :

L’hémostase est un système complexe faisant appel aux plaquettes, aux cellules endothéliales vasculaires et à un réseau de protéines plasmatiques.

Ce mécanisme est normalement déclenché dans le secteur extravasculaire pour colmater une blessure et arrêter une hémorragie.

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La cascade d’activation enzymatique mise en jeu aboutit à la formation de thrombine qui est l’enzyme clé du système.

Générée localement et à forte concentration à la surface des plaquettes activées, elle recrute d’autres plaquettes, coagule le fibrinogène et accélère sa propre formation en activant les facteurs V et VIII.

Le caillot de fibrine est ensuite éliminé au cours du processus de fibrinolyse qui comporte deux étapes : la transformation du plasminogène en plasmine par l’activateur tissulaire du plasminogène (tissue plasminogen activator [t-PA]) et la dégradation du substrat par la plasmine.

Coagulation et fibrinolyse sont étroitement régulées.

La thrombine, diluée dans le flux circulatoire, est maintenue au-dessous d’un seuil critique par plusieurs mécanismes inhibiteurs, dont l’antithrombine (AT) et le système de la protéine C (PC) sont les principaux.

La régulation de la plasmine fait intervenir le plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1), inhibiteur rapide et spécifique du t-PA, et l’a2-antiplasmine.

Les thromboses résultent d’une activation de l’hémostase au sein du système vasculaire.

La défaillance des systèmes inhibiteurs de la coagulation, un excès de facteurs procoagulants et au sein du système fibrinolytique, le déficit en plasminogène et l’excès de PAI-1 peuvent théoriquement favoriser leur survenue.

Les déficits héréditaires en inhibiteurs de la coagulation ont été les premières anomalies génétiques des facteurs de la coagulation associées à un risque accru de thrombose veineuse récidivante (thrombophilie), pathologie initialement considérée comme monogénique.

La découverte plus récente de l’implication de polymorphismes fréquents a modifié cette conception.

Il est bien établi à ce jour que la pathologie thrombotique (veineuse et artérielle) est multicausale, faisant intervenir de multiples facteurs de risque génétiques et circonstanciels.

Anomalies génétiques des protéines de la coagulation. Facteurs de risque de thrombose établis :

A - DÉFICITS EN INHIBITEURS DE LA COAGULATION (ANTITHROMBINE, PROTÉINE C, PROTÉINE S) :

1- Protéines. Gènes :

* Antithrombine :

L’AT est une glycoprotéine plasmatique monocaténaire de masse moléculaire 58 kDa, comportant 432 acides aminés (AA) et quatre chaînes latérales oligosaccharidiques.

L’AT est synthétisée par le foie et sa concentration plasmatique moyenne est de 125 mg/L. Sa demivie plasmatique moyenne est de 65 heures.

L’AT appartient à la superfamille des inhibiteurs de sérine protéases (serpines).

Elle inactive essentiellement la thrombine et le facteur X activé (a), mais également, en présence d’héparine, les facteurs VIIa, XIa et XIIa.

L’inactivation de la protéase implique la formation d’un complexe entre le site actif de l’enzyme et le site réactif de l’inhibiteur, formé par l’Arg 393 et la Ser 394 (P1-P1’).

L’AT joue le rôle de pseudosubstrat pour l’enzyme.

En effet, le clivage de la liaison P1-P1’ induit un changement de conformation important de l’AT qui peut alors former un complexe stable avec la protéase cible par incorporation des AA situés en amont de l’Arg 393 dans une structure en feuillet (constituée dans la forme non clivée de cinq brins et dans la forme clivée de six brins, le sixième étant constitué de segment P1-P14.

L’inhibition de l’enzyme par l’AT est catalysée par l’héparine et les protéoglycanes de l’endothélium vasculaire. Cette interaction accélère l’inhibition de la thrombine d’un facteur d’environ 2 000.

En présence d’héparine, la boucle du site réactif de l’AT est plus exposée à la surface de la protéine et s’adapte plus facilement au site catalytique de certains facteurs activés, comme le facteur Xa.

Dans le cas de la thrombine, qui possède comme l’AT des sites de fixation pour l’héparine, il y a formation d’un complexe ternaire qui rapproche l’enzyme de son inhibiteur.

Le domaine de liaison à l’héparine de l’AT comporte la région des AA 41 à 49 d’une part, et celle des AA 107 à 156 d’autre part.

Les deux régions sont riches en AA basiques qui peuvent interagir avec les groupements sulfates de l’héparine.

Elles sont voisines dans la structure tertiaire de la protéine.

Le gène codant l’AT est situé sur le chromosome 1, comporte sept exons et s’étend sur 13 480 paires de bases.

Il existe dix séquences Alu dans les introns, représentant 22 % des séquences introniques, soit quatre fois plus que dans l’ensemble du génome humain.

Le rôle de ces éléments répétitifs est inconnu, mais ils peuvent certainement contribuer à la survenue de mutations par délétion d’un segment du gène après recombinaison entre séquences homologues.

* Protéine C :

La PC est une glycoprotéine plasmatique de masse moléculaire 62 kDa, vitamine K-dépendante, comportant 23 % de carbohydrates.

Il s’agit du zymogène d’une sérine protéase à propriétés anticoagulantes.

La PC est synthétisée par le foie et circule dans le plasma à la concentration de 3 à 5 mg/L.

Sa demi-vie est de 6 à 8 heures.

Le gène de la PC, situé sur le chromosome 2, s’étend sur 11,6 kb et comprend neuf exons.

Chacune des régions codantes correspond à un domaine fonctionnel, sauf l’exon I qui n’est pas traduit.

Deux polymorphismes de la région promotrice du gène qui influent sur le taux de PC ont été identifiés (- 1654 C->T, - 1641 A->G).

Le génotype CC/GG, associé aux taux de PC les plus bas, est facteur de risque de thrombose.

La PC est synthétisée sous forme d’un polypeptide monocaténaire de 461 AA comportant un peptide leader, un site de reconnaissance de la c-carboxylase vitamine K-dépendante, une chaîne lourde et une chaîne légère.

La PC mature, sous forme bicaténaire, résulte des clivages protéolytiques intracellulaires qui induisent la perte du prépropeptide et le clivage de la forme monocaténaire.

La chaîne légère comporte un domaine (résidus 1 à 45) contenant neuf acides c carboxyglutamiques (GLA) et deux domaines (résidus 46 à 91 et 92 à 136) analogues à l’epidermal growth factor (EGF).

La chaîne lourde comporte le domaine sérine protéase (185, 419) et un peptide d’activation N terminal lié au domaine catalytique.

Le site catalytique est constitué de trois AA : His 211, Asp 257 et Ser 360.

Le domaine GLA permet la fixation d’ions calcium et la formation du complexe enzymatique à la surface de phospholipides anioniques.

In vivo, un complexe formé par la thrombine et son récepteur endothélial, la thrombomoduline, convertit la PC inactive en PC activée (PCa) capable de dégrader les facteurs Va et VIIIa.

L’activation résulte du clivage de la liaison Arg 169-Leu 170 et de la libération du dodécapeptide N terminal de la chaîne lourde qui démasque la poche catalytique.

* Protéine S :

La PS est le principal cofacteur de la PC.

C’est une glycoprotéine monocaténaire vitamine K-dépendante, de masse moléculaire 69 kDa, comprenant 7 % de carbohydrates.

Sa concentration plasmatique est de 20 à 25 mg/L et sa demi-vie de 42 heures.

La PS est produite par le foie, mais elle a également été localisée dans la cellule endothéliale, le mégacaryocyte et la cellule de Leydig.

Elle est synthétisée sous forme d’un précurseur de 676 AA comprenant une séquence leader éliminée avant la sécrétion, un peptide signal hydrophobe et un propeptide comportant le site de reconnaissance de la carboxylase analogue à celui des autres facteurs vitamine K-dépendants.

La forme mature de la PS, comportant 635 AA, consiste en un domaine GLA comportant 11 résidus GLA, un peptide de liaison, une boucle sensible à la thrombine (BST), quatre domaines EGF et une région carboxyterminale présentant des zones d’homologie par rapport à la sex hormone binding globuline (SHBG).

La PS augmente l’affinité de la PCa pour les phospholipides chargés négativement, formant un complexe PCa-PS lié à la membrane qui rend les facteurs Va et VIIIa plus accessibles au clivage par la PCa.

La PS circule dans le plasma pour partie sous forme libre (40 % de la PS circulante), active dans le système de la coagulation, pour partie (60 %) sous forme complexée à la C4b binding protein (C4bBP), protéine du système du complément qui lie la PS au niveau du domaine SHBG.

La PS liée à la C4bBP n’a pas d’effet cofacteur de la PCa. Le gène codant la PS a été localisé sur le chromosome 3.

Il existe en fait deux gènes présentant 98 % d’homologie : un gène actif (comportant 15 exons s’étendant sur plus de 80 kb) et un pseudogène (non codant, très proche du gène).

2- Déficits héréditaires :

* Fréquence et phénotypes intermédiaires :

Les déficits constitutionnels en AT, PC et PS, se manifestant par des thromboses veineuses chez l’adulte, se transmettent habituellement sur le mode autosomique dominant.

Le déficit en AT est retrouvé chez 1 à 2% des patients atteints de maladie thromboembolique veineuse primitive.

La prévalence du déficit en AT symptomatique dans la population générale est comprise entre 1/2 000 et 1/5 000.

Le déficit en PC est retrouvé chez 3 % des patients atteints de maladie thromboembolique veineuse primitive.

Les modes de transmission du déficit en PC apparaissent cependant complexes.

En effet, il ressort d’études de cohortes de patients thrombophiliques que la prévalence du déficit en PC associé à des thromboses dans la population générale est comprise entre 1/16 000 et 1/36 000.

Une prévalence beaucoup plus forte du déficit en PC asymptomatique a cependant été mise en évidence dans des populations saines de donneurs de sang (1/200 à 1/700).

Une forme beaucoup plus sévère du déficit peut refléter un état homozygote.

Le déficit en PS est retrouvé chez 2 à 3 % des patients thrombophiliques.

Aucune étude de la prévalence du déficit en PS dans la population générale n’a été publiée.

L’extrapolation des résultats obtenus dans des cohortes de patients atteints de thrombose permet de l’estimer à 1/33 000.

Les déficits héréditaires en AT et PC peuvent être quantitatifs (type I) ou qualitatifs (type II).

Un défaut de sécrétion de la protéine, objectivé par le déficit en antigène, est à l’origine du déficit de type I.

Dans les déficits de type II, la protéine est sécrétée normalement, mais présente une anomalie fonctionnelle.

Les déficits en AT de type II peuvent être divisés en trois groupes.

Dans les déficits de type II-reactive site (IIRS), l’anomalie porte sur le site actif.

Dans les déficits de type II-heparin binding site (IIHBS), le site actif est normal, mais le site de liaison à l’héparine est modifié.

Dans les déficits de type II à effet pléiotropique (IIPE), la capacité de liaison de l’AT à l’héparine et sa capacité d’inhibition des protéases sont toutes deux affectées, ainsi qu’à un degré moindre, la sécrétion de la protéine.

On distingue les déficits en PC de type II activité amidolytique (IIAM) et de type II activité anticoagulante (IIAC).

Dans les déficits de type IIAM, l’activité enzymatique est diminuée.

Dans les déficits de type IIAC, l’activité anticoagulante de la protéine est diminuée, bien que le site catalytique soit intact.

Ces déficits affectent l’un des sites d’interaction de la PC et des autres partenaires du système.

En ce qui concerne la PS, il existe de plus des déficits de type III, caractérisés par une PS libre basse contrastant avec une PS totale normale.

Les déficits de types I et III seraient en fait l’expression d’un même génotype.

* Bases moléculaires :

L’anomalie moléculaire responsable du déficit en AT a été identifiée dans de nombreux cas et l’ensemble des mutations décrites a été regroupé dans une base de données régulièrement mise à jour.

Les grandes délétions du gène, relativement rares, expliquent moins de 10 % des déficits de type I.

La plupart des mutations retrouvées dans les déficits de type I sont des mutations ponctuelles, des insertions ou des délétions de petite taille (1 à 30 nucléotides) qui peuvent altérer le processing de l’acide ribonucléique (ARN) messager, induire un arrêt prématuré de la synthèse ou la production d’une protéine instable ou non sécrétée.

Les déficits de type II sont le plus souvent la conséquence de mutations ponctuelles qui entraînent la substitution d’un AA responsable du dysfonctionnement de la protéine.

Les mutations qui génèrent des déficits de type IIRS affectent les AA 392, 393, 394, 382 et 384 du site actif.

La plupart des mutations responsables de déficits de type IIHBS sont des mutations faux sens, affectant les résidus Arg 47 et Arg 129 chargés positivement.

Leur remplacement par un AA non chargé peut diminuer les interactions ioniques nécessaires à la catalyse de l’inhibition AT protéase par l’héparine.

Les mutants à effet PE (pléiotropique) sont généralement porteurs de substitutions des résidus 402 à 407 situés dans la région P9’-P14’ de l’AT.

Le défaut d’inhibition de la thrombine mis en évidence pourrait être la conséquence d’une anomalie de l’insertion du segment au sein de la molécule d’AT.

L’anomalie de l’affinité de l’AT pour l’héparine pourrait démontrer l’existence d’un lien conformationnel entre le site de liaison à l’héparine et le site actif.

Dans les déficits de type PE, des traces de protéine anormale peuvent être mises en évidence dans le plasma. En ce qui concerne les déficits en PC, une base de données rapporte l’ensemble des mutations décrites.

Les mutations retrouvées dans les déficits de type I sont la plupart du temps des mutations ponctuelles faux sens. Les délétions et les insertions ne surviennent que dans 10 % des cas.

Un tiers des mutations ponctuelles surviennent au niveau des nucléotides CpG, qui sont des points chauds de mutation.

La plupart des mutations entraînent un arrêt prématuré de la synthèse ou une modification de la conformation protéique induisant une perte de stabilité. Dans les déficits de type II, qui sont plus rares (10 % des déficits rapportés), des mutations faux sens sont retrouvées principalement au niveau du domaine GLA et du domaine catalytique, dans la séquence du prépropeptide et au niveau du site de clivage par la thrombine.

Les mutations décrites dans les déficits en PS ont également récemment fait l’objet d’une base de données.

Dans plus de la moitié des cas, il s’agit de mutations faux sens.

On observe également des micro-insertions ou délétions et quelques codons stop.

Quelques grandes délétions ont été mises en évidence.

Les mutations ponctuelles entraînant un arrêt prématuré de la synthèse ou une modification de la conformation protéique sont cependant plus fréquentes que les délétions.

Quelques substitutions d’AA survenant au site de clivage du propeptide ou dans les domaines EGF génèrent des déficits qualitatifs.

* Manifestations cliniques :

+ Déficits hétérozygotes :

Les déficits héréditaires en AT, PC et PS induisent une maladie thromboembolique essentiellement veineuse.

Le risque relatif de thrombose veineuse associé à la présence d’un déficit à l’état hétérozygote est, d’après les données de la littérature, de l’ordre de 10 à 40 pour l’AT, de 5 à 10 pour la PC ou la PS.

Le risque artériel n’apparaît pas augmenté.

Près de 90 % des épisodes thrombotiques sont des thromboses veineuses profondes des membres inférieurs, avec ou sans embolie pulmonaire.

Les thromboses veineuses survenant dans des sites inhabituels, telles que les thromboses veineuses mésentériques ou les thromboses cérébrales, sont rares (moins de 5 % des accidents).

Les thromboses veineuses superficielles sont plus fréquentes chez les patients porteurs d’un déficit en PC ou en PS que chez les déficients en AT.

La maladie thromboembolique se développe chez 60 à 80 % des patients déficitaires en AT, PC et PS.

Le premier accident survient le plus souvent entre 15 et 45 ans. Des récidives de thrombose sont observées dans la moitié des cas.

Le déficit en AT est un facteur de risque thrombotique plus fort que le déficit en PC ou en PS.

La moitié des accidents thrombotiques surviennent dans des situations à risque de thrombose (chirurgie, grossesse, alitement prolongé).

La fréquence des thromboses survenant pendant la grossesse ou le postpartum est de l’ordre de 40 % chez les déficitaires en AT, de 15 % chez les déficitaires en PC ou en PS, de 28 % chez les patientes porteuses de la mutation Leiden du facteur V.

La prise de contraceptifs oraux oestroprogestatifs augmente fortement le risque thrombotique, en particulier chez les déficitaires en AT.

Les risques thrombotiques associés aux déficits qualitatifs ou quantitatifs sont généralement similaires, à l’exception du risque associé au déficit en AT de type IIHBS qui est très faible (6 %).

+ Déficits homozygotes :

Le déficit homozygote en AT de type I ou de type IIRS est probablement incompatible avec la vie.

L’expression clinique du déficit homozygote en AT de type IIHBS est précoce.

Il s’agit d’une maladie thromboembolique sévère, avec parfois des manifestations artérielles.

La fréquence du déficit homozygote ou hétérozygote composite en PC a été estimée à 1/60 000-1/360 000.

Lorsque la concentration plasmatique en PC est nulle, des manifestations cliniques gravissimes de type purpura fulminans peuvent survenir dès la naissance ou dans la première année de la vie.

En présence de concentrations en PC de 5 à 25%, les manifestations cliniques se rapprochent de celles qui sont observées chez les hétérozygotes.

La prévalence des thromboses survenant chez les hétérozygotes apparentés à un patient atteint de déficit homozygote est faible (5 % contre 50 % dans les familles de déficitaires sans homozygotie).

Les causes de cette discordance ne sont pas connues.

Le déficit homozygote en PS se traduisant par un purpura fulminans a été beaucoup plus rarement rapporté.

* Diagnostic biologique :

Le diagnostic de déficit en AT, PC ou PS utilise en première intention les techniques de dosage de la protéine circulante.

Le caractère constitutionnel de l’anomalie ne peut être affirmé qu’après contrôle de la permanence du déficit, vérification de l’absence de toute cause de déficit acquis et enquête familiale.

L’analyse du gène est le plus souvent inutile en ce qui concerne le diagnostic de déficit en AT.

Les informations apportées par l’analyse du gène de la PC et de la PS conduisent à envisager une application diagnostique de la biologie moléculaire dans un certain nombre de cas.

+ Déficit en antithrombine :

L’association de méthodes mesurant l’activité de la protéine en présence et en l’absence d’héparine avec une méthode immunologique permet de faire le diagnostic et de typer le déficit.

Le dépistage s’effectue par la mesure de l’activité cofacteur de l’héparine, à l’aide d’un substrat synthétique qui, lorsqu’elle est réalisée dans de bonnes conditions analytiques, décèle l’ensemble des anomalies.

Lorsque l’activité cofacteur de l’héparine est abaissée (inférieure à 80 %) et après confirmation de la permanence du déficit, il est impératif de réaliser un dosage par méthode immunologique.

Ce dosage permet de confirmer un déficit de type I si la concentration est inférieure à 80 %, ou de suspecter un déficit de type II s’il existe une divergence avec l’activité cofacteur de l’héparine.

Dans ce cas, la mesure de l’activité AT ou antifacteur Xa en l’absence d’héparine (activité progressive) permet de différencier les types IIHBS et IIRS.

Les déficits de type IIPE sont caractérisés par une différence modeste entre la concentration immunologique et l’activité cofacteur de l’héparine.

La présence de traces de protéine non fonctionnelle n’est révélée que par des techniques électrophorétiques.

Les traitements par héparine non fractionnée diminuent la concentration plasmatique d’AT de 10 à 20 %.

En présence d’un taux pathologique d’AT, un contrôle doit être pratiqué après 5 jours d’arrêt du traitement.

+ Déficit en protéine C :

Le diagnostic biologique de déficit en PC est rendu difficile par la variété des anomalies moléculaires responsables du défaut d’expression de l’allèle muté.

Ainsi, des concentrations de PC comprises entre 60 et 80 % sont observées aussi bien chez des sujets normaux que chez des sujets hétérozygotes.

Aucune technique commercialisée ne permet de dépister tous les types de déficit en PC, car aucune d’entre elles (pour des raisons de praticabilité) n’utilise l’activateur physiologique de la PC, le complexe thrombine-thrombomoduline.

La technique de dépistage la plus pertinente est celle qui mesure l’activité anticoagulante de la PC activée par une enzyme extraite d’un venin de serpent, le protac.

Lorsque l’activité anticoagulante est diminuée (inférieure à 70 %), il faut systématiquement, après contrôle de la permanence de l’anomalie, pratiquer un dosage immunologique par une technique enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa), méthode immunoenzymatique.

La méthode amidolytique permet de différencier les déficits qualitatifs de types IIAM et IIAC.

L’analyse du gène de la PC n’est totalement justifiée que dans le contexte d’homozygotie ou d’hétérozygotie composite avec complications thrombotiques sévères à la naissance, pour permettre un diagnostic anténatal en cas de nouvelle grossesse dans la famille.

Elle peut de plus être intéressante dans quelques cas particuliers : identification d’hétérozygoties lorsque la concentration plasmatique de la PC est comprise entre 60 et 80 %, résolution de phénotypes familiaux complexes.

+ Déficit en protéine S :

L’association de trois méthodes de dosage de la PS (évaluant la PS totale, la PS libre et son activité) est indispensable au dépistage et au typage des déficits.

La concentration immunologique de la PS totale et de la fraction libre est le plus souvent évaluée par dosage immunoenzymatique.

L’activité cofacteur de la PCa se mesure à l’aide d’un test de coagulation globale par l’effet anticoagulant exercé par le plasma du malade en présence de PCa sur un plasma déplété en PS enrichi en facteur V bovin.

Comme pour la PC, l’analyse du gène de la PS n’est totalement justifiée que dans le contexte d’homozygotie associée à des manifestations thrombotiques.

Le diagnostic de déficit héréditaire en PC ou en PS ne peut se faire qu’en dehors de tout traitement par les antivitamines K, au besoin lors d’une fenêtre thérapeutique, après passage à l’héparine de bas poids moléculaire (HBPM) ou à un dérivé, pendant le mois qui précède l’examen.

* Attitude thérapeutique :

+ Déficit hétérozygote :

Le traitement curatif classique de la maladie thromboembolique veineuse par HBPM ou par héparine non fractionnée, puis par antivitamine K, est généralement efficace chez les patients porteurs d’un déficit constitutionnel en AT, PC ou PS.

Les patients déficitaires en AT peuvent présenter une relative résistance à l’héparine qui oblige à utiliser des posologies plus fortes pour obtenir une anticoagulation satisfaisante.

L’administration de concentrés d’AT est rarement nécessaire, sauf dans les cas de déficit homozygote de type IIHBS.

La durée du traitement anticoagulant oral est discutée en fonction de l’histoire thrombotique personnelle et familiale.

Chez les sujets déficitaires n’ayant pas d’antécédents de thrombose, il n’est généralement pas prescrit de traitement anticoagulant préventif systématique.

En revanche, une prévention, le plus souvent par HBPM, est instaurée dans toute situation à risque (intervention chirurgicale, alitement prolongé, grossesse ou post-partum).

Le port d’une contention élastique est également indiqué dans certains cas.

Le risque thrombotique apparaît élevé pendant toute la grossesse et le post-partum chez les déficitaires en AT, et le recours aux concentrés d’AT est parfois nécessaire pendant l’accouchement.

Chez les déficitaires en PS, le risque serait plus important en post-partum que pendant la grossesse. Les médicaments oestroprogestatifs sont totalement contre-indiqués chez les femmes déficitaires.

Ceci n’est pas le cas de certains progestatifs purs. Un traitement anticoagulant oral ne doit jamais être débuté d’emblée sans couverture héparinique chez un patient porteur d’un déficit en PC.

En effet, la chute rapide de la PC déclenchée par la prise d’antivitamine K induit un déséquilibre de la balance hémostatique qui a été rendu responsable de la survenue de nécroses cutanées.

+ Déficit homozygote :

Chez les enfants porteurs d’un déficit homozygote ou hétérozygote composite en PC présentant un purpura fulminans à la naissance, l’administration de concentrés de PC est une thérapeutique efficace.

Ces concentrés sont également utilisés lors du relais héparine-vitamine K chez les déficitaires adultes ayant des antécédents de nécrose cutanée.

B - MUTATION LEIDEN DU FACTEUR V :

1- Protéine et mutations :

Le facteur V est une glycoprotéine de 300 kDa, codée par un gène localisé sur le chromosome 1 comportant 25 exons.

Le facteur V comporte plusieurs domaines A1A2BA3C1C3.

Le domaine B est éliminé après clivage du facteur V par la thrombine, et le facteur Va ainsi formé est un cofacteur du facteur Xa qui active la prothrombine en thrombine.

Le facteur Va est physiologiquement dégradé par protéolyse limitée par la PCa qui clive les liaisons en position 306 et 506 de la chaîne lourde.

L’addition de PCa purifiée à un plasma normal induit un allongement du temps de céphaline activé (TCA) qui reflète la dégradation accrue des facteurs Va et VIIIa par la PCa.

La première observation d’un défaut d’allongement du TCA du plasma supplémenté en PCa, donc d’une diminution de l’effet anticoagulant de la PCa chez des patients atteints de thrombophilie familiale, a été faite par Dahlbäck et al en 1993.

Cette résistance plasmatique à la PCa (RPCA) est un facteur de risque de thrombose très fréquemment retrouvé dans les populations d’origine européenne.

Dans la plupart des cas, la RPCA est conséquence de la présence de l’existence d’un facteur V anormal (facteur V Leiden), comportant en position 506 une glutamine à la place d’une arginine.

La substitution d’AA résulte d’une mutation ponctuelle du gène induisant le remplacement de la guanine en position 1691 par une adénine.

Cette mutation modifie l’un des sites de clivage du facteur Va par la PCa.

Plusieurs groupes ont étudié les cinétiques d’inactivation du facteur Va. Pour l’un d’entre eux, le clivage initial survient en 506 et favorise le clivage en 306.

Ce deuxième clivage est fondamental vis-à-vis de l’inactivation de la protéine.

Pour un autre, le clivage se produit sur les deux sites simultanément, mais est plus lent en 306.

Le clivage en 506 constitue, pour cette équipe, le mécanisme principal d’inactivation.

Ainsi, la mutation Leiden du facteur V réduit la vitesse de dégradation du facteur Va (par réduction du clivage en 506 ou par défaut d’accélération du clivage en 306).

Elle pourrait de plus modifier une autre fonction du facteur V, son effet cofacteur de la PCa et de la PS vis-à-vis de la dégradation du facteur VIIIa.

La mutation n’entraîne, en revanche, aucune modification des fonctions procoagulantes du facteur V.

Les bases moléculaires de la RPCA apparaissent plus simples que celles des déficits en PC ou en PS, puisque la plupart des patients qui ont une RPCA anormale sont porteurs de la même mutation.

La RPCA induite par la présence du facteur V Leiden peut être modulée par d’autres polymorphismes du gène du facteur V.

Ainsi, il existe deux allèles fréquents, appelés HR1 et HR2, définis par cinq polymorphismes de restriction dans l’exon 13 et une variation de séquence dans l’exon 16.

La fréquence de l’allèle HR2 est de l’ordre de 10 % dans la population générale.

La mutation Leiden du facteur V affecte toujours l’allèle HR1.

Des données récentes suggèrent que l’allèle HR2 code un facteur V moins sensible à l’action de la PCa et que l’association de l’allèle HR1 portant la mutation Leiden avec l’allèle HR2 renforce le phénotype de RPCA.

2- Risque thromboembolique veineux associé à la présence du facteur V Leiden/RPCA :

Les données épidémiologiques ont établi sans ambiguïté l’implication du facteur V Leiden et de la RPCA dans la maladie thromboembolique veineuse.

Cette relation a été tout d’abord mise en évidence dans la Leiden Thrombophilia Study (LETS), une grande étude cas-témoin hollandaise comportant 474 sujets atteints de thrombose veineuse et 474 témoins appariés sur l’âge et le sexe (risque relatif significatif de 2,7) puis dans de nombreuses autres études.

Cette mutation, qui résulte d’un effet fondateur, est observée dans les populations normales avec une fréquence variable (5 % en moyenne en Europe) en fonction de la localisation géographique.

Elle augmente le risque de développer une thrombose veineuse profonde d’un facteur 5 à 10 lorsqu’elle est présente à l’état hétérozygote.

Ce facteur de risque ne s’exprime en fait, le plus souvent, que dans des situations à risque de thrombose (contraception orale, grossesse...) ou chez des patients atteints d’autres facteurs génétiques de risque (déficits en PC, PS).

Ainsi, le risque relatif de thrombose veineuse profonde chez les femmes ayant une contraception oestroprogestative est multiplié par 4 par rapport à une population contrôle sans contraception, alors qu’il est multiplié par 30 chez celles qui sont hétérozygotes pour le facteur V Leiden et qui ont un traitement oestroprogestatif.

Néanmoins, si en termes de risque relatif cette augmentation est importante, en termes de risque absolu on passe d’un risque de 2,2 à 27,7/10 000 femmesannée, ce qui est faible.

Compte tenu de la forte prévalence de l’anomalie dans la population générale, de nombreux patients sont susceptibles d’être porteurs de l’anomalie à l’état homozygote (0,06 à 0,25 %) ; le risque relatif de thrombose est alors plus important (50 à 100).

Cependant, l’expression clinique du déficit chez ces homozygotes est considérablement moins sévère que celle observée chez les patients porteurs d’un déficit homozygote en PC ou en PS.

Le facteur V Leiden n’est pas associé uniquement à la thrombose veineuse profonde des membres inférieurs.

Il est également facteur de risque de thrombose veineuse superficielle et de thrombose veineuse cérébrale.

Il pourrait être associé à la survenue de fausses couches tardives.

En revanche, il n’est pas associé à la survenue d’embolie pulmonaire isolée.

Cette singularité pourrait être expliquée par l’influence du facteur V Leiden sur la structure du caillot.

La mutation Leiden du facteur V pourrait, d’autre part, être associée à une réduction du risque de thrombose iliofémorale.

L’association du facteur V Leiden à la récidive de thrombose a fait l’objet de plusieurs études dont les résultats sont contradictoires.

3- Risque thrombotique artériel :

De nombreuses équipes ont étudié le rôle du facteur V Leiden dans la survenue d’infarctus du myocarde.

Dans l’étude prospective des médecins américains (PHS), la présence de la mutation n’était pas associée à la survenue d’un infarctus du myocarde ou d’un accident vasculaire cérébral ischémique.

Dans le cadre de l’étude cas-témoins de l’infarctus du myocarde (ECTIM) regroupant 643 patients et 726 témoins, aucune association significative n’était relevée.

Quelques études rapportent cependant des associations positives, particulièrement lorsque l’effet conjoint de la mutation et d’un facteur de risque environnemental a été étudié.

Ainsi, dans une étude cas-témoins de l’infarctus du myocarde survenant chez la femme jeune (88 patientes, 388 contrôles), l’usage du tabac augmente 32 fois le risque relatif d’infarctus du myocarde associé à la présence du facteur V Leiden qui, présent seul, est associé à un risque relatif beaucoup plus faible.

Le facteur V

Leiden n’est pas significativement associé à la survenue d’accident vasculaire cérébral.

4- Techniques de diagnostic :

Le diagnostic de la RPCA est réalisé à l’aide de techniques de dosage plasmatique.

La recherche de la mutation Arg 506 Gln du facteur V fait appel aux techniques de biologie moléculaire.

* Mesures plasmatiques de la RPCA :

Il s’agit essentiellement de techniques coagulométriques.

Les premiers tests mesuraient le degré d’allongement du TCA du plasma du patient en présence de PCa.

Ces tests n’étaient pas spécifiques de la RPCA Arg 506 Gln-dépendante, un allongement du TCA (déficit en facteur, traitement anticoagulant) ou la présence d’un anticoagulant circulant de type lupus pouvant masquer l’anomalie.

Pour pallier certains de ces inconvénients, des techniques de deuxième génération ont été développées.

Les tests, de principe globalement inchangé, sont effectués sur des mélanges de plasma du patient et de plasma normal déplété en facteur V.

Ils peuvent être utilisés en cas de déficit en facteur et chez les patients traités par antivitamine K.

Même si les tests sont effectués dans des conditions de bonne standardisation sur des échantillons correctement déplaquettés, leur spécificité et leur sensibilité vis-àvis de la mutation Arg 506 Gln ne peuvent pas être parfaites.

* Recherche de la mutation Arg 506 Gln :

Les techniques de biologie moléculaire développées sont nombreuses.

Classiquement, la première étape consiste en une amplification de la région du gène du facteur V (exon 10) contenant le site de la mutation.

Cette amplification peut être réalisée sur l’acide désoxyribonucléique (ADN) purifié, ou sur sang total.

Les amorces d’amplification sont des amorces classiques ou modifiées, soit pour introduire un site de restriction lorsque l’allèle muté est amplifié, soit pour générer une amplification spécifique de l’allèle normal ou de l’allèle muté.

L’étude de la migration électrophorétique des fragments amplifiés natifs ou après digestion par enzyme de restriction aboutit au diagnostic.

Dans certains cas, la révélation se fait par hybridation, les sondes utilisées pouvant être radioactives ou froides.

La sensibilité et la spécificité de ces techniques sont de 100 %.

Elles permettent donc d’établir un diagnostic de certitude.

5- Attitude thérapeutique :

La mutation Arg Q506 Gln du facteur V ne s’exprime, le plus souvent, que dans des situations à risque de thrombose ou chez des patients porteurs d’autres facteurs génétiques de risque.

L’attitude thérapeutique qui peut être proposée est la suivante : chez les porteurs de la mutation à l’état hétérozygote sans histoire thrombotique personnelle ou familiale et sans autre anomalie de la coagulation, une prophylaxie est proposée dans les situations hautement thrombogènes (par exemple chirurgie majeure).

La contraception oestroprogestative n’est pas contre-indiquée formellement.

L’attitude thérapeutique à long terme adoptée chez les hétérozygotes symptomatiques n’est pas, à ce jour, consensuelle.

L’incertitude de la relation du facteur V Leiden vis-à-vis de la récidive de thrombose et l’absence de relation vis-à-vis de la survenue d’embolie pulmonaire nuisent à l’adoption d’un consensus.

Lors d’un premier épisode de thrombose, les hétérozygotes sont traités de la même façon que les sujets porteurs d’un déficit en AT, PC ou PS.

Chez les homozygotes et les hétérozygotes porteurs d’une seconde anomalie génétique, asymptomatiques, une prophylaxie est instaurée dans toutes les situations à risque.

C - MUTATION LEIDEN DE LA PROTHROMBINE :

1- Découverte. Risque thrombotique veineux :

La prothrombine est une protéine de 72 kDa qui, après clivage par le facteur Xa au sein du complexe prothrombinase, est transformée en thrombine, enzyme clé de l’hémostase aux multiples facettes fonctionnelles.

En effet, la thrombine est :

– un activateur plaquettaire puissant ;

– un partenaire essentiel du système procoagulant, car elle gère la transformation du fibrinogène en fibrine ;

– un partenaire essentiel du système PC/PS (complexée à la thrombomoduline, elle transforme la PC en PCa).

En 1996, le groupe de Bertina a identifié, par séquençage de la région 3’ non transcrite du gène de la prothrombine (facteur II), une substitution nucléotidique (20210 G/A) (mutation Leiden du facteur II) associée à un risque accru de thrombose veineuse.

L’ADN de 28 sujets qui avaient une histoire personnelle et familiale de thrombose a été initialement étudié.

La mutation était présente chez 18 % des sujets malades, mais chez seulement 1 % des sujets sains étudiés en parallèle.

Le risque relatif de thrombose associé à la présence de cette substitution a été déterminé dans la LETS ; 6,2 % des patients et 2,3 % des témoins étaient porteurs de l’allèle A donnant un risque relatif significatif de thrombose de 2,8.

L’allèle A était de plus associé significativement à une augmentation de la concentration circulante de prothrombine, elle-même facteur de risque de thrombose (odds ratio [OR] 2,1 pour une concentration plasmatique de facteur II supérieure à 115 %).

Les mécanismes moléculaires impliqués ne sont pas, à ce jour, élucidés.

La fréquence de cette mutation chez les Européens est de l’ordre de 2 %.

Elle est plus fréquente au sud de l’Europe qu’au nord, très rare en Afrique et en Asie. L’analyse d’haplotype a démontré qu’elle résulte d’un effet fondateur.

Les résultats de plusieurs études cas-témoins publiées récemment confirment le risque accru de thrombose veineuse (phlébite et embolie pulmonaire) (OR compris entre 2 et 6 suivant les études), associé à la présence de l’allèle A.

Nous disposons de peu d’informations au sujet du risque de récurrence associé à la présence de cet allèle et les résultats obtenus dans deux études prospectives récentes sont contradictoires.

Dans deux études rétrospectives, la présence simultanée des mutations Leiden du facteur V et du facteur II était associée à un risque de récidive accru (OR 2,6 et 4,8 respectivement).

Ces résultats demandent à être confirmés dans des études prospectives rigoureuses.

2- Risque thrombotique artériel :

L’implication de la mutation 20210 G/A du facteur II dans la survenue d’infarctus du myocarde et d’accident vasculaire cérébral a été étudiée par quelques équipes. Pour l’infarctus du myocarde, les résultats obtenus dans deux études cas-témoin sont évocateurs d’un effet délétère potentiel de l’allèle A (OR significatif de l’ordre de 4), en particulier chez les femmes jeunes, mais dans d’autres études, aucun effet n’a pu être mis en évidence.

L’allèle A pourraît être associé à un risque accru d’accident vasculaire cérébral ischémique de l’adulte jeune.

3- Techniques de diagnostic :

La recherche de la mutation Leiden du facteur II fait obligatoirement appel aux techniques de biologie moléculaire.

Toutes les techniques classiques de détection des mutations ponctuelles peuvent être employées (amplification suivie d’une digestion par enzyme de restriction, d’une hybridation ; amplification spécifique d’allèle, etc).

Des techniques d’amplification multiplexes permettent la recherche simultanée des mutations Leiden du facteur V et du facteur II.

4- Attitude thérapeutique :

L’attitude thérapeutique est similaire à celle qui est adoptée chez les porteurs de la mutation Leiden du facteur V.

D - AUGMENTATIONS DU FACTEUR VIII CIRCULANT D’ORIGINE GÉNÉTIQUE :

Le facteur VIII est une glycoprotéine de grande taille (330 kDa) codée par un gène localisé sur le chromosome X, mesurant 186 kb et comportant 26 exons.

La protéine mature comporte 2 351 AA.

Sa structure est analogue à celle du facteur V. Le facteur VIII comporte comme le facteur V six domaines A1A2BA3C1C2, dont le rôle est assez bien connu, à l’exception du rôle du domaine B, très sensible à la protéolyse.

Le facteur VIII circulant est stabilisé par le facteur Willebrand au sein d’un complexe non covalent.

Lors de l’activation du facteur VIII par la thrombine ou le facteur Xa, le domaine B est éliminé.

Le facteur VIIIa se comporte comme un cofacteur du facteur IXa au sein du complexe tenase.

La concentration plasmatique du facteur VIII dans la circulation est extrêmement variable, dépendante d’influences multiples, dont l’inflammation.

Il a été récemment démontré que des augmentations permanentes du facteur VIII circulant (indépendantes de la réaction inflammatoire) sont associées à un risque accru de thrombose veineuse (premier accident et récidive).

Ainsi, dans la LETS, les concentrations de facteur VIII supérieures à 150 % étaient associées à un risque relatif de thrombose significatif de 4,8.

La concentration plasmatique du facteur VIII est largement déterminée par le groupe sanguin et la concentration plasmatique du facteur Willebrand. Néammoins, un déterminisme familial des concentrations plasmatiques du facteur VIII, indépendant de ces paramètres, a été mis en évidence.

Les gènes impliqués dans cette modulation sont, à ce jour, inconnus.

La recherche dans les régions promotrice et 3’ du gène du facteur VIII de polymorphismes modulateurs a été négative.

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