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Médecine légale
Empreintes génétiques
Cours de Médecine Légal
 
 
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L’identification génétique, appelée improprement « empreintes génétiques » par analogie aux empreintes digitales, cherche à différencier les individus par la mise en évidence de polymorphismes situés sur la molécule d’ADN (acide désoxyribonucléique).

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Il s’agit du progrès majeur réalisé en médecine légale durant cette dernière décennie.

Les régions polymorphes peuvent être situées soit sur l’ADN non codant (séquences répétitives appelées micro- ou minisatellites en fonction de leur longueur) soit sur l’ADN codant (formes multi-alléliques d’un gène).

Ces analyses effectuées sur l’ADN nucléaire et mitochondrial sont réalisées à partir de toutes les cellules de l’organisme et constituent un apport indispensable en criminalistique.

Le pouvoir de discrimination de ces analyses permet d’identifier de façon quasi certaine des traces biologiques.

Elles ne donnent aucune indication quant au phénotype du sujet, à son âge ou à son appartenance raciale.

Pour étudier le polymorphisme de l’ADN, 2 techniques sont utilisées : la première consiste à comparer la taille de fragments de restriction et la deuxième fait appel à l’amplification génique ou PCR (polymerase chain réaction).

Actuellement, cette dernière technique est la plus employée.

Méthodes :

La mise en évidence de ce polymorphisme génétique nécessite l’extraction de l’ADN à partir du noyau ou des mitochondries des cellules présentes dans les échantillons à analyser.

Après une lyse cellulaire, l’ADN est détaché des nucléoprotéines à l’aide d’un détergent anionique (SDS pour sodium dodécyl sulfate, Sarkosyl) et une digestion protéolytique des protéines dénaturées est effectuée.

La purification de la molécule est réalisée soit par une extraction organique (phénol) puis précipitation de l’ADN à l’alcool, soit par une extraction non organique au moyen de résines qui adsorbent l’ADN puis récupération de la molécule.

A - Analyse des fragments de restriction :

1- Obtention des fragments de restriction :

L’ADN est digéré par des enzymes de restriction qui le sectionnent à des endroits précis appelés sites de restriction.

Il en résulte une fragmentation de l’ADN qui est propre à chaque individu.

Les fragments ainsi obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d’aragose ; il s’agit d’un procédé qui range les fragments en fonction de leur taille à l’aide d’un gradient créé par un courant électrique.

Une fois les fragments séparés les uns des autres, ils sont transférés à partir du gel sur une membrane nylon par capillarité (selon le procédé décrit par Southern en 1975).

Ils sont ensuite révélés à l’aide de sondes moléculaires qui sont des séquences nucléotidiques complémentaires des régions à analyser marquées soit radioactivement (phosphore 32) soit enzymatiquement (phosphatase alcaline).

La fixation des sondes, appelée hybridation, sur les fragments complémentaires est mise en évidence par autoradiographie.

Actuellement, des méthodes de marquage non radioactives sont basées sur la transformation d’un substrat incolore en produit coloré à l’aide d’une réaction enzymatique déclenchée par la liaison entre un fragment et la sonde complémentaire liée dans ce cas à une enzyme.

2- Analyse de l’image autoradiographique :

• L’image ou le profil autoradiographique dépend du choix des sondes.

Les sondes actuellement employées en criminalistique sont des sondes uniloculaires comme par exemple YNH24 (D2S44) et MS43A (D12S11).

Ces sondes reconnaissent une région déterminée de l’ADN située sur un chromosome précis.

Dans ce cas, l’image autoradiographique se caractérise par la présence d’une ou de deux bandes selon que l’individu est homozygote ou hétérozygote pour la région de l’ADN explorée.

• Il s’agit toujours d’une analyse comparative entre les profils génétiques obtenus à partir d’un échantillon médicolégal et ceux établis à partir d’un prélèvement sanguin de référence.

B - Analyse par amplification génique :

1- Principes de l’amplification génique :

Pour multiplier une séquence d’ADN, l’amplification génique utilise l’ADN polymérase qui est impliquée dans les phénomènes de réplication naturelle de l’ADN au cours de la division cellulaire.

Comme pour la réplication naturelle de l’ADN, cette technique présente plusieurs étapes et nécessite au préalable la séparation des 2 chaînes complémentaires de l’ADN double brin appelée dénaturation, puis la synthèse de la chaîne d’ADN complémentaire de chacun des 2 brins dénaturés selon la règle de l’appariement des bases.

Les 2 chaînes synthétisées sont des copies conformes des brins initiaux de l’ADN.

Ce processus de dénaturation et de synthèse de l’ADN est répété lors de 25 à 35 cycles et les molécules nouvellement synthétisées au cours de chaque cycle peuvent servir de matrice à l’ADN polymérase au cours du cycle suivant.

La région à amplifier est repérée sur la molécule d’ADN par de courtes séquences polynucléotidiques appelées amorces, à partir desquelles sont synthétisées les premières chaînes d’ADN complémentaire à la région initiale.

Les régions à amplifier sont sélectionnées en raison de leur degré de polymorphisme et peuvent concerner soit des séquences répétitives non codantes (D1S80, D17S13, D21S11) soit codant une protéine donnée (par exemple : HLA.DQ-alpha, apolipoprotéine B).

2- Technique de l’analyse :

Cette méthode est rapide et sensible.

Les régions amplifiées sont visualisées par électrophorèse sur gel et exposition aux rayons ultraviolets après coloration au bromure d’éthidium, soit par dot-blot, technique dans laquelle ce sont les sondes nucléotidiques, et non l’ADN amplifié, qui sont fixées à la membrane nylon.

La révélation des allèles peut être colorimétrique.

Ainsi lors d’utilisation d’amorces biotinylées à leur extrémité 5’, et une fois l’hybridation entre la sonde et l’allèle amplifié réalisée, la streptavidine conjuguée à la peroxydase provoque au contact de la biotine la transformation d’un substrat incolore en un substrat bleu.

Une tache bleue apparaît lorsqu’il y a hybridation entre une sonde et un allèle amplifié correspondant.

L’analyse des séquences amplifiées peut également être réalisée par lecture directe des nucléotides par les techniques de séquençage.

L’amplification génétique permet d’analyser de courtes séquences répétées situées par exemple au niveau des gènes, de l’apolipoprotéine B, du collagène type II (Col 2A1), de la région DQ du système HLA (human leucocyte antigen) et des microsatellites situés au niveau du gène de la tyrosine hydroxylase humaine, du gène du facteur von Willebrand, du proto-oncogène humain CFES/ FPS, du gène de la sous-unité 1 du facteur de coagulation XIII A.

Ces microsatellites ainsi que d’autres sont actuellement amplifiables de façon simultanée grâce à des kits commerciaux qui regroupent les amorces permettant d’amplifier ces différentes régions et l’amplification peut être réalisée simultanément lors d’une même réaction d’amplification et être détectée par lecture sur automate à laser en marquant l’amplificat de chaque microsatellite par un fluorochrome différent.

3- ADN mitochondrial :

Les régions polymorphes de l’ADN mitochondrial présentent des variations dans la composition en nucléotides.

Il ne s’agit plus de variations de longueur mais de mutations ponctuelles au niveau de la région de contrôle de la mitochondrie (D-Loop) qui sont recherchées.

Le polymorphisme est moins marqué que pour l’ADN nucléaire rendant l’analyse moins discriminante que celle portant sur l’ADN nucléaire.

L’analyse est réalisée sur séquenceur automatique permettant la détermination d’environ 600 à 700 nucléotides.

La séquence déterminée est comparée à une séquence de référence publiée par Anderson en 1981.

Les points de mutation sont identifiés et comparés entre l’échantillon biologique analysé et le suspect.

Ces comparaisons permettent soit d’affirmer une exclusion si plus de 3 différences sont observées entre les 2 séquences d’ADN, soit de prononcer une identité entre 2 séquences et d’incriminer le suspect.

Indications :

Les analyses biologiques d’identification génique peuvent être réalisées à partir de toute cellule nucléée de l’organisme humain.

Elles peuvent ainsi être pratiquées sur divers tissus de l’organisme comme le foie, la rate, et à partir des cellules de bulbes pileux, de poils et de cheveux et des cellules buccales présentes dans la salive.

Pour établir les profils de comparaison, c’est-à-dire les empreintes de la victime et du ou des suspects, l’ADN est extrait le plus souvent de leucocytes contenus dans un échantillon de sang, ou des cellules buccales prélevées par écouvillonnage.

Une fois extrait, l’ADN peut être conservé à - 20 °C (ou - 80 °C) pendant de longues périodes avant d’être analysé.

Ce délai permet aux enquêteurs de retrouver le (ou les) suspect(s) et aux laboratoires de ne pratiquer l’analyse qu’une fois en possession des échantillons sanguins de comparaison relevés sur la victime et le (ou les) agresseur(s).

A - Applications en médecine légale :

Les applications en médecine légale des empreintes génétiques concernent d’une part l’identification d’auteurs de crimes de sang ou d’agressions sexuelles à partir de traces biologiques laissées sur le lieu des faits ou sur les victimes et d’autre part, les recherches de filiation et les identifications de corps.

1- Agression sexuelle :

La technique, dans le cas de viol, permet d’identifier avec une quasi-certitude l’agresseur à partir des spermatozoïdes recueillis sur les frottis vaginaux effectués sur la victime.

Les spermatozoïdes contiennent l’ADN de l’agresseur qui est analysé et comparé à l’empreinte génétique du suspect établie à partir d’un prélèvement sanguin sur ce dernier.

L’empreinte de la victime est également réalisée pour lui attribuer le profil génétique établi à parti des cellules vaginales prélevées par le frottis vaginal.

2- Crime de sang :

La même démarche est utilisée en présence d’une tache de sang où l’empreinte génétique est réalisée à partir des globules blancs présents sur la tache puis comparée à celle de la victime et à celle du suspect établie à partir d’un prélèvement sanguin.

3- Accident :

Cette méthode peut être employée pour prouver l’implication d’un véhicule dans un accident de la voie publique avec délit de fuite si du matériel humain est découvert sur la carrosserie de ce véhicule.

Dans ce cas, l’empreinte génétique établie à partir des cellules retrouvées sur la voiture est comparée à celle de la victime.

Si les empreintes correspondent, il est alors établi que le véhicule portant les traces biologiques a bien percuté la victime.

4- Filiation :

Les recherches de filiation sont également réalisées par cette technique. Comme l’hérédité des régions d’ADN obéit aux lois mendéliennes, et connaissant la fréquence des allèles (bandes visibles sur les autoradiographies) supposés indépendants au sein d’une population déterminée et regroupés dans une base de données, il est possible d’établir la preuve d’une filiation avec une très haute probabilité.

Ainsi, une paternité ou une maternité (dans les affaires de substitution d’enfant) peuvent être établies.

5- Identification de cadavre :

Un problème fréquent en médecine légale est celui de l’identification d’un cadavre inconnu.

La solution peut être apportée par un contrôle de filiation dès lors que les ascendants ou les descendants sont présumés.

Le tissu osseux ou dentaire pourra être utilisé dans ces cas, même lors de carbonisation partielle.

B - Stratégie d’analyse :

L’interprétation des résultats consiste à comparer les profils génétiques obtenus après amplification des régions variables, notamment STR (short tandem repeats) entre les traces biologiques (taches de sang, de sperme, poils, etc.) et un prélèvement dit de comparaison (prélèvement de sang ou de salive) du suspect et de la victime.

Si les allèles du suspect pour les différents marqueurs génétiques étudiés sont de tailles différentes de ceux caractérisant l’ADN de la trace biologique, il n’y a pas d’identité entre les 2 ADN et le sujet n’est pas à l’origine de cette trace, il y a donc exclusion formelle.

Si les 2 allèles du suspect correspondent en taille à ceux de la trace, il y a inclusion, c’est-à-dire que les 2 molécules d’ADN proviennent du même individu.

Dans la mesure où l’analyse ne porte que sur une partie de la molécule d’ADN, un autre individu pourrait posséder, du fait du hasard, les mêmes caractéristiques génétiques, c’est-à-dire les mêmes allèles sur la partie restante non explorée de l’ADN.

De ce fait, pour réaliser l’interprétation, il faut disposer de la distribution de la fréquence de chacun des allèles du ou des marqueurs génétiques étudiés dans la population générale.

Le résultat de l’inclusion ou de l’identification comporte l’indication de la fréquence du génotype (constitué de un ou deux allèles selon que le sujet est homo- ou hétérozygote) dans la population générale.

L’analyse d’une seule région variable de l’ADN est donc insuffisante pour permettre une identification et plusieurs systèmes doivent être analysés pour obtenir une fréquence suffisamment faible.

Ainsi, l’étude de 8 marqueurs permet d’obtenir une fréquence d’un génotype de un sur plusieurs milliards.

En matière de paternité, la comparaison porte sur le profil génétique de la mère, de l’enfant et du père putatif.

Au sein du profil de l’enfant, l’allèle maternel est identifié et l’existence de l’allèle du père présumé sera recherché dans le profil de l’enfant.

S’il y a un allèle commun entre le père et l’enfant, le père présumé peut être identifié comme le père biologique en indiquant la fréquence de cet allèle dans la population générale ; au contraire, si aucun allèle du père n’est retrouvé dans le profil de l’enfant, il y a exclusion et il ne s’agira pas du père biologique de l’enfant.

Aspects juridiques et éthiques :

Depuis la loi n° 94-653 du 29 juillet 1994, ces analyses d’identification génétique peuvent être réalisées :

– soit à des fins médicales ou scientifiques après avoir obtenu préalablement le consentement de la personne dans les conditions de l’article L.

145-15 du Code de la Santé publique ;

– soit dans le cadre d’une procédure d’enquête ou d’instruction diligentée lors d’une procédure judiciaire (Code pénal art. 226-25 à 32).

Les personnes qui pratiquent ces analyses doivent être titulaires de l’agrément prévu à l’article L.

145-16 du Code de la Santé publique, et dans le cadre d’une procédure judiciaire, elles doivent de plus être inscrites sur une liste d’experts judiciaires (art. 16-22 du Code civil) et satisfaire aux contrôles de qualité organisés par l’Agence du médicament.

En matière civile, l’identification génétique ne peut être réalisée qu’en exécution d’une mesure d’instruction ordonnée par le juge saisi d’une action tendant soit à l’établissement ou la contestation d’un lien de filiation, soit à l’obtention ou la suppression des subsides (art. 16- 10 à 12 du Code civil).

Le consentement de l’intéressé doit être préalablement et expressément recueilli.

Rappelons que le recueil d’un échantillon biologique ne peut se faire qu’avec l’accord de la personne et notamment sur un suspect détenu même si le prélèvement est effectué à la demande d’un magistrat.

La mise en place d’un fichier national des empreintes génétiques nécessite la réalisation des profils génétiques associant plusieurs microsatellites établis sur des auteurs condamnés pour infractions sexuelles.

Il a été créé un fichier national automatisé d’empreintes génétiques par la loi n° 98-468 du 17 juin 1998, relatif à la prévention et la répression des infractions sexuelles ainsi qu’à la protection des mineurs.

Ce fichier est réglementé par l’article 706-54 du nouveau Code de procédure pénale.

D’après ce texte, ce fichier national automatisé est destiné à centraliser les traces génétiques ainsi que les empreintes génétiques des personnes condamnées pour l’une des infractions suivantes : « meurtre ou assassinat d’un mineur précédé ou accompagné d’un viol, de tortures ou d’actes de barbarie » (article 706-47) ou l’une des infractions visées aux articles 222-23 à 222-32 et 227-22 à 227-27 du Code pénal en vue de faciliter l’identification et la recherche des auteurs d’infractions sexuelles. Ce fichier est placé sous le contrôle d’un magistrat.

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