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Gynécologie
Diagnostic pré-implantatoire
Cours de Gynécologie
 
Obstétrique
 
 

Histoire du diagnostic pré-implantatoire :

Les premières applications cliniques du diagnostic pré-implantatoire (DPI) furent rapportées en 1990.

Un diagnostic de sexe était alors réalisé par la technique de polymerase chain reaction (PCR) sur les embryons de couples susceptibles de transmettre une maladie génétique récessive liée à l’X ; seuls les embryons femelles étaient transférés dans l’utérus maternel.

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Les premiers DPI spécifiques d’une maladie génétique donnée ont suivi rapidement, puisque dès 1992, un DPI de mucoviscidose était proposé par étude de la mutation deltaF508.

Depuis, l’amélioration constante des protocoles de PCR et le développement de nouvelles méthodologies d’analyse génétique appliquées aux cellules isolées ont permis d’élargir rapidement le spectre des pathologies géniques pouvant faire l’objet d’un DPI.

Introduction :

Le diagnostic pré-implantatoire consiste en un diagnostic génétique sur une ou deux cellules d’un embryon en comportant six à huit, avant son transfert in utero.

Il se fait sur plusieurs embryons pour sélectionner ceux indemnes de l’affection redoutée.

Il est le résultat de la pratique de la fécondation in vitro (FIV) avec micro-injection de spermatozoïdes (ICSI) et du développement des techniques de cytogénétique moléculaire et de génétique moléculaire.

Cette approche concerne les couples ayant un risque connu de transmettre une maladie grave et incurable.

Les couples concernés par le DPI ont une histoire douloureuse d’interruption médicale de grossesse suite à un diagnostic prénatal et/ou un ou plusieurs enfants gravement atteints ou décédés.

L’intérêt du DPI est non seulement d’éviter une interruption médicale de grossesse, mais également d’avoir un enfant indemne de l’affection.

La performance de la FIV avec ICSI est primordiale.

Elle s’adresse le plus souvent à des couples fertiles qui ont déjà obtenu une ou des grossesses spontanément. Le choix des techniques de

laboratoire (biopsie, techniques de cytogénétique ou génétique moléculaire) et la stratégie de transfert embryonnaire sont importants pour la qualité du DPI et l’amélioration des chances de grossesse, tout en diminuant les contraintes du biologiste responsable du diagnostic définitif.

Principe et législation du DPI :

Le DPI est autorisé, en France, par la loi n ° 94-654 du 29 juillet 1994, relative au don et à l’utilisation des éléments et produits du corps humain, à l’assistance médicale à la procréation et au diagnostic prénatal.

Selon l’article L.2131-4, le diagnostic biologique effectué à partir de cellules prélevées sur l’embryon in vitro n’est autorisé qu’à titre exceptionnel dans les conditions suivantes :

– un médecin exerçant son activité dans un centre de diagnostic prénatal pluridisciplinaire doit attester que le couple, du fait de sa situation familiale, a une forte probabilité de donner naissance à un enfant atteint d’une maladie génétique d’une particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic ;

– le diagnostic ne peut être effectué que lorsque a été préalablement et précisément identifiée, chez l’un des parents, l’anomalie (ou les anomalies) responsable(s) d’une telle maladie ;

– les deux membres du couple expriment par écrit leur consentement à la réalisation du diagnostic ;

– le diagnostic ne peut avoir d’autre objet que de rechercher cette affection ainsi que les moyens de la prévenir et de la traiter ;

– il ne peut être réalisé que dans un établissement spécifiquement autorisé à cet effet après avis de la Commission nationale de médecine et de biologie de la reproduction et du diagnostic prénatal et dans des conditions définies par décret en Conseil d’État.

Le législateur n’a donc autorisé le recours au DPI qu’à titre exceptionnel, uniquement pour éviter la naissance d’un enfant gravement malade ou handicapé.

À ce jour, en France, trois centres sont agréés (Strasbourg, Paris, Montpellier).

Bilan avant DPI :

Le DPI implique une fécondation in vitro avec ICSI dans le but d’obtenir plusieurs embryons ensuite soumis à l’analyse monogénique ou chromosomique.

Il est destiné aux couples fertiles ou infertiles, et/ou porteurs de maladies transmissibles graves et incurables.

A - CONSULTATION DE CONSEIL GÉNÉTIQUE :

Son but est d’attester la pertinence de l’indication du DPI, et de confirmer, si besoin, le diagnostic.

Membre d’un centre pluridisciplinaire de diagnostic prénatal, le généticien reçoit le couple demandeur en entretien privé.

Il reprend avec lui son histoire personnelle et familiale, dresse l’arbre généalogique, évalue le risque de récurrence pour la maladie concernée.

Il revoit le parcours obstétrical (avortements spontanés, nombre d’enfants vivants malades) et évalue les motivations de la demande.

Il explique la procédure de DPI, la place des différents intervenants, la mise au point technique sur une cellule, les risques d’erreur.

Enfin, il envisage également avec le couple d’autres solutions (diagnostic prénatal, don de gamètes, adoption), en particulier si le DPI n’est pas techniquement réalisable.

Le dossier de chaque couple est discuté en réunion multidisciplinaire.

Une attestation du centre multidisciplinaire de diagnostic prénatal doit être délivrée pour tous les couples dont l’indication de DPI est retenue.

B - BILAN PRÉ-FIV/ICSI :

La fécondation in vitro avec ICSI permet aux couples (à risque de transmettre une maladie génétique) d’obtenir plusieurs embryons en vue d’établir leur statut génétique, afin de ne transférer que le ou les embryons sains.

Une cohorte suffisante d’embryons assure la présence d’au moins un embryon sain.

La nécessité d’obtenir plusieurs embryons est due à :

– l’influence de la pathologie sur le nombre d’embryons non atteints et donc transférables ;

– la perte de matériel entre la ponction ovocytaire et le transfert embryonnaire ;

– l’influence du nombre d’embryons transférés sur le taux de grossesses.

En effet, il existe une corrélation entre la pathologie héréditaire et le nombre d’embryons non atteints.

De même, le nombre d’embryons transférés in utero influence significativement les taux de grossesses chez ces mêmes couples.

Moins de 50 % des ovocytes recueillis donneront des embryons à biopsier.

Ainsi, les patientes sont sélectionnées sur des critères classiques avec une extrême vigilance.

L’annulation des cycles contenant moins de six follicules escomptés doit être discutée ; entre six et huit, l’annulation doit être débattue avec le couple.

L’âge de la patiente est un facteur prédictif majeur de bonne réponse à la stimulation de l’ovulation.

Les dosages hormonaux au troisième jour du cycle menstruel (follicle stimulating hormone [FSH], luteinizing hormone [LH], estradiol) sont indispensables pour évaluer le potentiel de réponse ovarienne à la stimulation.

L’évaluation de la cavité utérine se fait par hystérosalpingographie et/ou par hystéroscopie.

Le partenaire est également exploré par un spermogramme associé à un spermocytogramme, même si l’ICSI est la technique de choix pour réaliser un DPI.

C - INFORMATIONS DONNÉES AUX COUPLES :

L’information des couples est essentielle avant la réalisation d’un DPI et doit porter sur :

– la fécondation in vitro avec ICSI, ses risques et son efficacité (protocole de stimulation de l’ovulation, monitorage, ponction folliculaire, transfert embryonnaire, grossesses multiples, taux de naissance) ;

– la biopsie embryonnaire, technique utilisée pour la perforation de la zone pellucide ;

– le diagnostic génétique et les risques d’erreur ;

– la recommandation de réaliser un diagnostic prénatal pour confirmer le résultat du DPI.

Modalité et déroulement d’un DPI :

A - STIMULATION DE L’OVULATION POUR FIV :

Le choix du protocole, des produits et de leur posologie dépend de l’âge de la patiente, de son bilan hormonal à j3 du cycle, de son indice de masse corporelle et, si cela est le cas, des antécédents de réponse ovarienne à des protocoles antérieurs de stimulation de l’ovulation.

Hors cas particuliers, les protocoles longs associant agoniste de la gonadotrophin releasing hormone (GnRH) et FSH sont retenus compte tenu de leur performance et de la possibilité de programmation.

En effet, la programmation est essentielle car la réalisation d’un DPI mobilise toute une équipe indissociable à un moment donné (biologiste, clinicien, généticien).

B - CHOIX DE L’ICSI :

Afin d’éviter toute contamination via les spermatozoïdes fixés sur la zone pellucide, l’ICSI est la technique de choix pour un DPI.

La PCR, en particulier sur une ou deux cellules, nécessite des précautions drastiques.

Il s’agit d’éviter toute contamination par de l’ADN extérieur :

– celui des divers opérateurs et intervenants ;

– l’ADN volatile des PCR antérieures ;

– celui des cellules du cumulus oophorus ou des spermatozoïdes qui peuvent contaminer le prélèvement de blastomères si le ou les embryons ont été obtenus en fécondation in vitro classique.

C - DÉROULEMENT D’UNE ICSI :

1- Préparation des spermatozoïdes :

Les spermatozoïdes sont sélectionnés sur un gradient de densité.

Les spermatozoïdes sont ensuite lavés et le culot obtenu est resuspendu dans un milieu de culture.

Quelle que soit l’origine du sperme (éjaculat, épididymaire ou testiculaire), une préparation du sperme doit être faite ; ensuite les spermatozoïdes sont déposés dans l’incubateur à CO2 jusqu’au moment de la micro-injection.

2- Retrait des cellules du cumulus et examen des ovocytes :

Les ovocytes recueillis sont mis dans un milieu de culture.

Les cellules du cumulus sont dissociées après incubation des ovocytes durant 1 minute dans un milieu de culture contenant de la hyaluronidase (2 %, 30 secondes).

Les cellules du cumulus sont retirées par aspiration-refoulement des ovocytes dans une micropipette en verre.

Ensuite, les ovocytes sont observés au microscope inversé.

L’aspect morphologique et la maturité nucléaire sont notés. Seuls les ovocytes matures (métaphase II) ayant expulsé leur premier globule polaire sont micro-injectés.

3- Réalisation de l’ICSI :

Une fois les deux micropipettes (contention et injection) placées sur le micromanipulateur, l’injection d’un spermatozoïde dans l’ovocyte s’effectue en microgouttes sous huile de paraffine à l’aide de deux micropipettes :

– une de contention (holding) pour maintenir l’ovocyte pendant l’injection proprement dite ;

– l’autre d’injection utilisée pour immobiliser et aspirer le spermatozoïde, puis l’injecter dans le cytoplasme de l’ovocyte.

Les ovocytes injectés sont remis en milieu de culture à 37 °C sous 5 % de CO2.

La fécondation est observée 18 à 22 heures post microinjection par l’apparition des deux pronuclei et l’expulsion du second globule polaire.

D - DÉROULEMENT D’UNE BIOPSIE EMBRYONNAIRE :

La biopsie embryonnaire se fait 72 heures après la micro-injection.

Les embryons sont en général au stade de six à huit cellules.

Avant le début de la biopsie, l’examen des embryons est réalisé en présence du biologiste (cytogénéticien ou généticien moléculaire) responsable du diagnostic.

La décision du nombre de blastomères à prélever pour chaque embryon est prise en commun.

La biopsie embryonnaire nécessite de créer une perforation dans la zone pellucide qui peut être faite soit par le tyrode acide, soit au laser.

Ensuite, un ou deux blastomères sont aspirés par la micropipette d’aspiration.

Le (ou les) blastomère(s) isolé(s) est (sont) mis à la disposition du biologiste responsable du diagnostic.

L’embryon biopsié est immédiatement remis en culture.

Il est important de visualiser le noyau du blastomère sélectionné en présence des biologistes responsables de l’analyse génétique.

Une photographie du blastomère est prise.

La biopsie embryonnaire sera répétée autant de fois qu’il y a d’embryons prêts à être prélevés.

La viabilité de l’embryon biopsié est notée.

Elle dépend fondamentalement de la difficulté et de la précision du geste, demandant une extrême reproductibilité.

E - EFFET DU NOMBRE D’OVOCYTES INJECTÉS ET DU NOMBRE D’EMBRYONS BIOPSIABLES :

Le taux de grossesses est corrélé au nombre d’ovocytes injectés et au nombre d’embryons biopsiables.

En effet, si le nombre d’ovocytes recueillis est supérieur à 9, le nombre d’embryons à biopsier, dans cette étude, est, en moyenne, de 7 comparativement à 2,2 si le nombre d’ovocytes est inférieur à 9.

De la même façon, les taux de grossesses par cycle sont respectivement de 20,9 % et 9 %.

De plus, ces mêmes auteurs ont trouvé une corrélation positive entre le nombre d’ovocytes récupérés et le nombre d’embryons biopsiés ainsi que le nombre d’embryons génétiquement sains.

Bien que le nombre d’ovocytes ne soit pas le seul critère sur lequel le succès de la tentative repose, il reflète la qualité de la réponse ovarienne à la stimulation, et donc les chances d’implantation.

F - TRANSFERT EMBRYONNAIRE :

Les embryons indemnes de la maladie sont ensuite transférés in utero au troisième ou quatrième jour postfécondation.

Le nombre d’embryons à transférer est discuté avec le couple avant de réaliser le geste lui-même afin de leur offrir un maximum de chances de réussite tout en limitant le risque de grossesses multiples.

Le transfert embryonnaire à j4 ne montre pas d’effet délétère alors qu’il existe, non seulement une plus grande sécurité au diagnostic génétique mais aussi une possibilité d’augmenter le nombre de recherches du fait du temps imparti au biologiste.

G - CONGÉLATION EMBRYONNAIRE :

La congélation des embryons sains surnuméraires n’a toujours pas donné de résultats satisfaisants.

Après cryoconservation, une seule grossesse a été rapportée sur le plan international en 2001 après transfert d’embryons sains biopsiés.

Cependant, le DPI peut être réalisé sur des embryons congelés-décongelés.

Cette approche a permis l’obtention de quelques naissances.

Aujourd’hui, la congélation peut être conseillée aux couples avec toute la prudence nécessaire quant aux chances de réussite.

Cytogénétique et DPI :

Les déséquilibres chromosomiques sont, chez l’homme, la cause principale des anomalies de la reproduction (avortements spontanés précoces, infertilité), des malformations congénitales et des retards mentaux.

Ces anomalies chromosomiques peuvent correspondre soit à des aneuploïdies, soit à des anomalies de structure chromosomique.

Ces aberrations ont un risque de survenue élevé lorsqu’elles sont liées à la présence d’une anomalie chromosomique de structure équilibrée présente chez l’un des membres du couple ou si l’âge maternel est élevé.

Le développement de la fluorescence in situ hybridisation (FISH) permet le diagnostic de déséquilibres chromosomiques dans les noyaux des cellules en interphase.

L’application de cette technique pour détecter des déséquilibres chromosomiques dans des blastomères ou des globules polaires permet de réaliser un DPI de déséquilibres chromosomiques constitutionnels hérités ou liés à l’âge maternel.

A - CYTOFIXATION :

Les blastomères sont d’abord fixés sur une lame de verre avant de réaliser l’hybridation in situ.

Le cytoplasme est digéré par mise en contact avec le blastomère d’une solution de lyse.

Généralement, les équipes utilisent la technique de Coonen (Hcl/Tween) ou de Tarkowsky (méthanol/acide acétique précédé d’un choc au citrate de sodium/BSA).

Cette lyse permet d’obtenir le noyau nu du blastomère et donc une accessibilité de la sonde à l’ADN du noyau.

Les lames sont ensuite traitées (élimination des restes cytoplasmiques dans un bain de pepsine puis fixation du noyau).

B - HYBRIDATION :

La technique FISH permet de déterminer partiellement le contenu chromosomique d’un noyau.

Le principe repose sur l’hybridation d’un fragment d’ADN (sonde) spécifique d’une région chromosomique et marqué par des nucléotides couplés à un fluorochrome, sur l’ADN de chromosomes interphasiques préalablement dénaturés.

La sonde est visualisée par le signal émis par le fluorochrome et apparaît sous forme d’un signal fluorescent dont la couleur dépend du fluorochrome utilisé.

Les sondes chromosomiques sont déposées sur la zone préalablement délimitée par un gravage au diamant permettant de localiser le blastomère.

Une lamelle est ensuite scellée avec du rubber cement puis une codénaturation est réalisée (69 °C, 5 à 7 minutes) permettant la dénaturation simultanée de l’ADN du noyau et des sondes.

Les lames sont ensuite mises à l’étuve (37 °C) pour une durée d’hybridation variable (2 à 3 heures pour les sondes centromériques et 16 heures pour les sondes télomériques).

C - DIFFÉRENTS TYPES DE SONDES UTILISÉES :

Ce sont des fragments d’ADN spécifiques d’une région chromosomique.

Les sondes peuvent être centromériques (sexage), ou spécifiques des bras longs des chromosomes (translocations Robertsoniennes) ou télomériques (translocations réciproques).

Pour les translocations réciproques, trois sondes sont utilisées (deux sondes distales par rapport au point de cassure pour chacun des deux chromosomes impliqués dans la translocation et une proximale par rapport au point de cassure pour un chromosome seulement).

Certaines translocations réciproques nécessitent l’usage de sondes spécifiques qu’il faut mettre au point et fabriquer à l’aide de YAC (yeast artificial chromosome) ou de BAC (bacterial artificial chromosome).

D - ANALYSE MICROSCOPIQUE :

Une fois la durée de l’hybridation terminée, une série de lavages est réalisée.

Puis, à l’aide d’un microscope à épifluorescence muni de filtres spécifiques, les signaux d’hybridation sont observés et interprétés.

En fonction du nombre et de l’aspect des signaux, un diagnostic est établi pour chaque embryon.

Génétique moléculaire et DPI :

Le diagnostic génétique d’une maladie monogénique sur un blastomère isolé représente l’étape la plus délicate du DPI en raison de différents facteurs susceptibles de compromettre la précision et la fiabilité du diagnostic.

La technique utilisée est la PCR qui permet l’amplification exponentielle in vitro de courts fragments du gène à analyser, grâce à des cycles successifs d’hybridation et de déshybridation.

Chaque cycle comprend :

– la dénaturation des deux brins matriciels d’ADN à haute température (94 °C) ;

– l’hybridation à plus faible température (60 °C) de deux courts fragments d’ADN simple brin, appelés amorces, sur les extrémités de la séquence nucléique à analyser ;

– la synthèse à partir des deux amorces d’un nouveau brin d’ADN par la Taq polymérase (72 °C).

À la fin de chaque cycle de PCR, la quantité d’ADN est doublée, ce qui en permet l’analyse. Bien que différents types de cellules soient théoriquement analysables en DPI (globules polaires, blastomères, cellules du trophoectoderme), la plupart des centres pratiquent le DPI après biopsie de blastomère sur des embryons de 3 jours, constitués alors généralement de six à dix blastomères totipotents.

Il est recommandé de prélever et d’analyser indépendamment deux blastomères provenant du même embryon, ce qui augmente la fiabilité du diagnostic lorsque les résultats de l’analyse des deux cellules sont concordants.

Cette approche est malheureusement souvent limitée par une qualité ou un développement embryonnaire insuffisant.

S’ajoutent des contraintes de temps puisque le diagnostic doit être réalisé dans les 12 à 48 heures après la biopsie, afin de transférer les embryons indemnes dans l’utérus maternel le plus rapidement possible pour ne pas compromettre leur viabilité.

Dès les premières tentatives de DPI réalisées par PCR, plusieurs difficultés inhérentes à l’analyse d’une seule cellule sont apparues :

– absence totale d’amplification ;

– contamination potentielle de l’échantillon à analyser ;

– phénomène d’allele drop out (ADO) correspondant à la nonamplification ou à la non-détection de l’un des deux allèles dans une cellule hétérozygote à un locus donné ;

– amplification préférentielle de l’un des deux allèles.

Ces difficultés doivent être connues et prises en compte dans la procédure globale de DPI et les avertissements donnés au couple.

A - CONTAMINATION :

Alors que l’analyse génétique d’une seule cellule (par exemple un blastomère) est réalisée à partir d’environ 6 à 7 pg d’ADN, le diagnostic génétique « classique » est basé sur l’amplification par PCR d’une quantité d’ADN génomique de l’ordre de 50 à 500 (soit l’équivalent de 10 000 à 100 000 cellules).

Cette infime quantité de matériel génétique disponible pour l’analyse en DPI nécessite la réalisation d’un grand nombre de cycles de PCR pour que la séquence amplifiée soit en quantité suffisante pour être analysable.

L’introduction accidentelle d’ADN exogène doit donc être absolument évitée. Les sources de contamination spécifiques au DPI peuvent être des cellules folliculaires d’origine maternelle entourant l’ovocyte, et un ou plusieurs spermatozoïdes restés accrochés à la zone pellucide de l’embryon lors de la procédure de FIV.

Ces contaminations peuvent être évitées en retirant minutieusement toutes les cellules folliculaires et en pratiquant systématiquement une ICSI.

D’autres sources de contamination incluent les cellules des manipulateurs réalisant la FIV ou le diagnostic génétique moléculaire, ainsi que les produits d’amplification d’expériences précédentes.

Il est donc impératif de travailler dans un laboratoire strictement dédié à l’étude des cellules uniques (matériels et réactifs réservés à cet usage), isolé des locaux dans lesquels sont analysés les produits d’amplification, et de revêtir une tenue vestimentaire adaptée.

B - « ALLELE DROP OUT » :

L’absence totale d’amplification d’une séquence du génome est indésirable (impossibilité d’établir un diagnostic et donc de transférer un embryon), mais le phénomène d’ADO est extrêmement grave en raison du risque d’erreur de diagnostic pouvant en découler.

Celui-ci est directement dépendant du mode de transmission de la maladie génétique étudiée.

Bien que les causes précises de l’ADO restent inconnues, ce phénomène semble varier en fonction de la technique de lyse cellulaire utilisée, des séquences d’ADN et du type cellulaire analysés, ainsi que de la taille des fragments nucléotidiques amplifiés.

Avant toute application clinique, les protocoles d’amplification et d’analyse doivent donc être rigoureusement mis au point et optimisés sur des cellules individualisées (lymphocytes, lymphoblastes ou fibroblastes isolés), afin de déterminer les taux d’amplification et d’ADO pour chaque séquence.

Ces travaux préparatoires nécessitent plusieurs mois d’expérimentation en fonction des caractéristiques associées aux séquences analysées et des techniques préanalytiques et analytiques choisies pour chaque cas.

Un diagnostic ne peut être appliqué au niveau clinique que si le taux d’amplification est supérieur à 90 % et si le taux d’ADO est inférieur à 10 % au niveau de cellules isolées.

Cependant, la qualité du matériel génétique des blastomères est variable, parfois médiocre, et malgré l’optimisation au préalable des protocoles de DPI, le taux d’absence d’amplification peut dépasser 10 % et l’ADO affecter près de 25 % des blastomères analysés.

Divers protocoles sont désormais développés afin d’être en mesure de détecter, le cas échéant, le phénomène d’ADO.

La PCR multiplex permet de coamplifier plusieurs séquences nucléiques, l’une pouvant contenir la mutation à l’origine de la pathologie génique étudiée, l’autre (ou les autres) renfermant des marqueurs polymorphes situés à proximité de la mutation ou du gène impliqué dans la maladie.

Cette approche diminue de façon drastique la probabilité d’erreur de diagnostic en permettant :

– de vérifier que les allèles identifiés dans l’embryon sont bien d’origine parentale et non dus à des contaminations extraembryonnaires ;

– de confirmer un diagnostic direct de mutation par une étude « indirecte » basée sur la ségrégation de marqueurs polymorphes de l’ADN ;

– de détecter un éventuel ADO ayant affecté la mutation.

Cette stratégie est couramment utilisée pour les DPI de pathologies dues à des mutations fréquentes telles que la mucoviscidose (analyse de la mutation deltaF508 et d’un microsatellite intragénique) ou la dystrophie myotonique de Steinert (analyse des répétitions de triplets CTG dont les expansions au-delà d’un certain seuil entraînent l’apparition de la maladie, ainsi que d’un microsatellite très proche du gène de la myotonie de Steinert).

Lorsqu’une pathologie n’est pas due à une mutation fréquente, que la mutation n’a pas été identifiée ou qu’elle n’est pas analysable à partir de l’ADN d’une seule cellule, il est également possible de développer des protocoles de PCR multiplex, basés sur la coamplification de deux ou trois marqueurs polymorphes intragéniques ou flanquant le gène impliqué.

L’intérêt majeur de ce diagnostic indirect est qu’il est applicable au plus grand nombre de familles sollicitant un DPI pour une même pathologie, sans devoir mettre au point un protocole d’amplification pour chacune des mutations responsables.

Cette stratégie a été appliquée, entre autres, au DPI du syndrome de l’X fragile, du syndrome de Marfan et du rétinoblastome héréditaire.

La technique de PCR nichée est fréquemment utilisée en DPI.

Deux PCR successives sont réalisées, la deuxième (PCR2) utilisant des amorces internes par rapport à celles utilisées lors de la PCR1. Cette technique permet d’augmenter l’efficacité et la spécificité de la réaction d’amplification.

L’introduction de protocoles de PCR fluorescente (utilisation d’amorces fluorescentes et détection des produits amplifiés dans un séquenceur automatique) dans l’analyse génétique unicellulaire a également permis d’améliorer considérablement la fiabilité du diagnostic car le système de détection est infiniment plus sensible qu’un système de détection « classique » (coloration de gels au bromure d’éthidium).

La combinaison des techniques de PCR multiplex et de PCR fluorescente peut être utilisée pour réduire encore davantage les erreurs de diagnostic.

Indications :

Le DPI concerne les couples à risque élevé de transmettre une maladie génétique, mais qui ne souhaitent pas recourir au diagnostic prénatal pour les raisons suivantes :

– opposition morale ou religieuse à l’interruption médicale de grossesse ;

– expérience douloureuse de pertes foetales par décès spontanés ou interruptions médicales de grossesses après diagnostic prénatal.

Il peut aussi être appliqué aux couples ayant une hypofertilité justifiant en soi le recours à une FIV et chez qui un risque génétique a été identifié :

– remaniement chromosomique chez un parent source de décès in utero, de naissances d’enfants lourdement handicapés ;

– maladie monogénique et nécessité d’une FIV (mucoviscidose et agénésie bilatérale des canaux déférents).

A - INDICATIONS DE DPI EN CYTOGÉNÉTIQUE :

Elles correspondent au diagnostic de sexe pour les maladies génétiques liées à l’X et au diagnostic des anomalies de structure telles que les translocations, les inversions ou les anomalies de nombre, homogènes ou en mosaïque.

1- Diagnostic de sexe :

Ce diagnostic est réalisé chez des couples à risque de transmettre une pathologie récessive liée au chromosome X, lorsque celui-ci ne peut pas être réalisé par les techniques de biologie moléculaire.

Lorsque le gène est connu et que la mise au point unicellulaire a été réalisée, la biologie moléculaire permet de réimplanter les embryons de sexe masculin indemnes de la maladie.

Le diagnostic du sexe chromosomique des embryons est réalisé par FISH sur un blastomère préalablement biopsié à l’aide de sondes spécifiques des chromosomes X et Y.

L’inconvénient, si le diagnostic est réalisé par FISH, est que seuls les embryons XX (féminins) seront transférés, puisque théoriquement un embryon masculin sur deux est à risque de transmettre la maladie.

L’avantage est qu’il s’agit d’une technique rapide (3 heures) permettant non seulement d’identifier les embryons de sexe féminin, mais également de mettre en évidence les embryons 45X (syndrome de Turner) ou ceux 47XXX, contrairement à la PCR qui ne permet pas de réaliser ces diagnostics.

2- Translocations :

Il en existe deux types :

– Robertsoniennes (fusion centromérique de deux chromosomes acrocentriques : chromosomes 13, 14, 15, 21 et 22) ;

– réciproques (échanges de segments chromosomiques entre deux chromosomes).

Un individu sur 900 est porteur d’une translocation Robertsonienne et un individu sur 625 est porteur d’une translocation réciproque.

Le but du DPI est donc de sélectionner les embryons sains ou porteurs équilibrés de la translocation.

L’individu du couple porteur de telles translocations peut avoir une ségrégation méiotique déséquilibrée des chromosomes impliqués dans la translocation, qui sera alors responsable d’un embryon porteur d’une aneuploïdie (monosomie ou trisomie).

Pour les translocations réciproques, le risque de déséquilibre chromosomique est fonction des chromosomes impliqués et de la localisation des points de cassure, et est donc caractéristique de chaque translocation.

Chaque couple porteur d’une translocation réciproque constitue un cas particulier pour lequel les risques de survenue dans la descendance de déséquilibre partiel doivent être établis de façon spécifique.

De tels diagnostics impliquent une mise au point longue, car la plupart du temps il est nécessaire de fabriquer des sondes spécifiques des points de cassure de la translocation.

3- Anomalies de nombre (aneuploïdie) et inversions :

Le diagnostic des anomalies de nombre correspond à certaines indications comme le syndrome de Klinefelter, la trisomie X, ou un double Y.

Les recherches d’aneuploïdie proposées pour âge maternel élevé (> 38 ans), avortements spontanés à répétition, échecs répétés de FIV, ou choix du sexe par convenance sont interdites en France mais proposées dans d’autres centres.

B - INDICATIONS DE DPI EN BIOLOGIE MOLÉCULAIRE :

Dans ce cadre, deux types de pathologies sont retenues :

– maladies monogéniques autosomiques récessives, dominantes pour lesquelles l’anomalie moléculaire peut être détectée grâce aux techniques de la biologie moléculaire ;

– maladies liées au chromosome X avec diagnostic par biologie moléculaire.

Si ce dernier est impossible, un diagnostic de sexe peut être proposé, dans certaines situations, pour éviter la naissance de garçons malades.

C - NOUVELLES INDICATIONS DU DPI :

Les principales indications du DPI sont celles du diagnostic prénatal, c’est-à-dire les maladies d’une particulière gravité, justifiant une interruption médicale de grossesse après diagnostic prénatal.

Mais la possibilité d’étudier un embryon avant même son implantation et de sélectionner les embryons non porteurs de certaines caractéristiques génétiques (mutations ou polymorphismes liés à une mutation) a ouvert la voie à de nouvelles indications parmi lesquelles le DPI pour les maladies génétiques d’apparition tardive telles que la maladie de Huntington.

En France, seuls peuvent bénéficier d’un DPI les patients ayant préalablement réalisé un diagnostic présymptomatique révélant qu’ils ont hérité de leur parent atteint de la mutation causale (une expansion anormale de répétitions CAG dans le gène de la maladie de Huntington).

Dans d’autres pays, on propose un DPI d’exclusion aux personnes ayant un parent atteint, ne souhaitant pas savoir s’ils le seront à leur tour, mais voulant s’assurer que leurs enfants seront indemnes.

Dans ce cas, une étude indirecte par haplotypage est réalisée, sans étudier directement la mutation : les embryons ayant hérité de l’haplotype du grand-parent atteint ne sont pas transférés, même s’il ne s’agit pas de l’haplotype lié au gène muté.

Aux États-Unis, des DPI ont également été réalisés pour la prédisposition à une forme précoce de maladie d’Alzheimer, de transmission autosomique dominante, via l’étude d’une mutation dans le gène APP.

Cette indication reste controversée car la maladie ne s’exprime pas chez 100 % des individus porteurs de la mutation.

La sélection d’embryons sur la base d’un typage HLA est également une nouvelle indication du DPI.

Cette approche a été appliquée pour l’anémie de Fanconi (FA), une maladie génétique de transmission autosomique récessive, dont le seul traitement est une greffe de moelle osseuse permettant de rétablir la fonction hématopoïétique chez les patients.

Un double DPI a été réalisé afin d’étudier simultanément la mutation familiale à l’origine de la FA (permettant la naissance d’un enfant sain) et d’identifier les embryons présentant une compatibilité HLA avec un enfant atteint, en vue d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques.

Ce premier DPI a ouvert le débat sur la conception d’enfants « médicaments », car un nombre croissant de couples sans antécédent familial de maladie génétique sollicite désormais un DPI de compatibilité HLA, uniquement dans le but de trouver un donneur compatible pour un enfant dans l’attente d’une greffe.

Selon la loi française, ce type de DPI n’est pas autorisé puisque les embryons n’ont pas spécialement de risque de présenter une maladie d’une particulière gravité.

Conclusion

Si les techniques en cytogénétique et en biologie moléculaire s’améliorent et permettent l’identification de plus en plus de maladies génétiques, la biologie de l’embryon humain pré-implantatoire avec ses éventuelles mosaïques fait que les risques d’erreurs sont à ce jour incontournables.

À cela, s’ajoutent les contraintes et les complications de la fécondation in vitro pour les couples dont la fertilité est normale et qui ont déjà une ou plusieurs grossesses spontanées (risque d’hyperstimulation, grossesses multiples, échecs de stimulation, échec de diagnostic, échec de grossesse).

Cependant, le DPI permet aux couples le non-transfert lorsque les embryons analysés sont atteints de la maladie recherchée.

Il évite la souffrance de voir s’arrêter une grossesse dans laquelle le couple s’est investi depuis de nombreuses semaines.

Depuis la publication du premier DPI par l’équipe anglaise de Handyside en 1990, le nombre de centres pratiquant cette activité a progressé.

Cependant, cette progression reste lente (25 centres selon l’enquête de l’European Society for Human Reproduction and Embryology, 2002).

La pratique du DPI nécessite l’implication et la collaboration de laboratoires performants de fécondation in vitro, de génétiques (moléculaires et chromosomiques) capables de pratiquer un diagnostic sur une ou deux cellules embryonnaires, et de cliniciens (généticiens, gynécologues, psychologues).

Quel que soit le nombre de cycles de DPI réalisé par an, cette approche nécessite de très importants besoins humains rassemblés au sein d’un centre multidisciplinaire comme l’exige la loi française.

La mise au point de techniques selon la maladie recherchée demeure actuellement le seul facteur limitant.

Ceci explique à ce jour l’important taux de refus pour non-faisabilité technique.

Cependant, de nombreuses anomalies génétiques peuvent être analysées aujourd’hui, et l’évolution permanente de procédures techniques laisse présager que certains problèmes persistants seront dans un avenir proche résolus et auront un impact fondamental sur la prise en charge des couples.

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