Rechercher dans le site  |   Devenir membre
      Accueil       |      Forum     |    Livre D'or      |     Newsletter      |      Contactez-nous    |                                                                                                          Envoyer par mail  |   Imprimer

 
Hématologie
Autogreffe de cellules souches hématopoïétiques en hématologie
Cours d'hématologie
 


 

Introduction :

En 1997, environ 14 000 autogreffes de CSH ont été réalisées dans le monde pour hémopathie maligne.

Au cours du développement des autogreffes, les méthodes de traitement ex vivo du greffon de CSH ont apporté à l’autogreffe ses lettres de noblesse, même si aujourd’hui la pertinence de ces méthodes n’a toujours pas été validée.

Ces 10 dernières années ont été marquées par l’évolution des biotechnologies et par l’avènement des cytokines hématopoïétiques.

L’utilisation des CSH est devenue la règle, conduisant à une diminution de la durée d’hospitalisation et des coûts de traitements.

Les informations les plus crédibles ont été apportées par la publication des premiers essais randomisés comparant les techniques d’intensification suivies d’autogreffe, avec les chimiothérapies conventionnelles dans le cadre d’essais de phase III.

L’augmentation du nombre d’autogreffes effectuées en hématologie au cours de ces 10 dernières années est impressionnante. Les rapports d’activité de l’Établissement Français des Greffes nous permettent d’apprécier cette évolution.

En 1997, parmi les 2 322 patients ayant reçu une autogreffe deCSH (ils étaient 1 630 en 1994), les hémopathies ont représenté 75 % des indications.

La source de CSH la plus utilisée aujourd’hui est le sang périphérique (86 % des cas).

Selon les régions, le nombre de patients adultes prélevés, par million d’habitants, pour obtenir un greffon de CSH sanguines, a varié de 20 à 75.

Les indications les plus fréquentes sont le myélome (32 %, contre 12 % en 1992), le lymphome non hodgkinien (LNH) (39 %), les leucémies aiguës (13 %), la maladie de Hodgkin (8,3 %) et la leucémie myéloïde chronique (LMC) (5 %).

Les conditionnements précédant la réinjection du greffon autologue ont pour but d’optimiser la cytoréduction tumorale et idéalement d’obtenir l’éradication de l’affection.

La faisabilité des chimiothérapies à fortes doses, en remplacement de l’irradiation corporelle totale (ICT), a été démontrée en situation allogénique.

Pour la plupart des chimiothérapies, une multiplication par trois de l’aire sous la courbe peut représenter in vitro une multiplication par dix de la cytotoxicité.

Les alkylants et les dérivés du platine produisent l’effet d’inhibition le plus net de la croissance tumorale pour une faible augmentation de la dose administrée.

En revanche, un effet plateau est rapidement obtenu avec les antimétabolites.

Les anthracyclines et l’étoposide ont une courbe dose-réponse intermédiaire.

Cependant, pour certaines de ces chimiothérapies, l’exposition prolongée peut accroître de façon considérable l’activité antitumorale, suggérant que la pharmacologie intracellulaire et les mécanismes d’arrêt de croissance impliquent différents mécanismes au niveau de leurs cibles intracellulaires.

Des études contradictoires ont été publiées sur l’effet du fractionnement de l’ICT sur l’efficacité antileucémique et la survie des malades.

En règle générale, l’augmentation de la dose totale délivrée, entraîne une diminution du taux de rechute, bien démontrée dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) en situation allogénique, mais ne permet pas d’augmenter la survie, en raison d’une augmentation de la mortalité liée au traitement.

Aspects techniques de l’autogreffe de cellules souches hématopoïétiques :

A - Prélèvement des cellules souches hématopoïétiques :

1- Première source : moelle osseuse

Le risque associé au prélèvement de moelle osseuse est faible et rejoint celui de l’anesthésie générale.

Dans une analyse de plus de 1 500 prélèvements de moelle osseuse chez des donneurs sains, l’incidence des complications mettant en jeu la vie du donneur était inférieure à 0,5 %.

La procédure peut être associée à une perte sanguine significative, nécessitant une transfusion de une à deux unités globulaires, d’autant plus que les patients éligibles pour un prélèvement de moelle osseuse sont souvent anémiques.

Le prélèvement consiste à aspirer, sous anesthésie générale, 800 à 1 200 mL de moelle, par ponctions multiples au niveau des os iliaques et parfois du sternum.

La moelle est recueillie dans des poches en plastique sur milieu enrichi comportant un anticoagulant.

La suspension de cellules médullaires est ensuite filtrée pour débarrasser le greffon des particules osseuses et graisseuses.

Un prélèvement correct doit contenir de 2 à 3. 108 cellules nucléées médullaires par kilogramme de poids du receveur.

La purification des CSH sur gradient de Ficoll Hypaque permet d’améliorer l’efficacité d’un éventuel traitement ex vivo du greffon et, en outre, de réduire les volumes à congeler.

Cette source a été progressivement abandonnée au profit des CSH d’origine sanguine.

2- Deuxième source : sang périphérique

Le pool de cellules souches circulantes peut être augmenté de façon significative par une stimulation précédant l’aphérèse de CSH.

Les agents utilisés pour mobiliser les CSH de la moelle vers le sang circulant sont soit une chimiothérapie, telle le cyclophosphamide (Endoxan Astat), mais rarement utilisée de façon isolée, soit le plus souvent des cytokines hématopoïétiques, soit la combinaison des deux.

Les CSH prélevées dans le sang par cytaphérèse doivent être capables de reconstituer l’hématopoïèse chez un malade dont la moelle osseuse a été détruite par le conditionnement.

Le greffon de CSH sanguines doit contenir, comme la moelle osseuse, à la fois des CSH pluripotentielles capables d’autorenouvellement, responsables d’une reconstitution hématopoïétique tardive mais stable et intéressant toutes les lignées, et des progéniteurs plus matures qui permettent une reconstitution hématopoïétique précoce mais transitoire, dont l’intérêt clinique est majeur (réduction du risque infectieux, moindre consommation de produits sanguins).

Le prélèvement de CSH utilise des séparateurs de cellules, dont le rendement respectif en CSH dépend du volume de sang total traité dans le séparateur.

Les complications les plus fréquentes liées aux cytaphérèses de CSH sont les occlusions du cathéter veineux central (16 %), les complications infectieuses (16 %), une anémie (30 %), une thrombopénie (15 %).

Les modalités de mobilisation des CSH les plus courantes font appel à des cytokines hématopoïétiques, dont les plus fréquemment utilisées sont le GMCSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) et surtout le G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor [facteur de croissance des colonies granuleuses], à la posologie de 5 à 20 íg/kg/j.

De nombreuses publications confirment la supériorité du G-CSF en termes de tolérance clinique et d’efficacité de mobilisation.

Avec le G-CSF, le nombre de CSH atteint un pic vers le 5e jour qui suit l’injection.

Plusieurs facteurs majorent le rendement du prélèvement de CSH.

Nous citerons le moindre nombre de cycles de chimiothérapies précédant la cytaphérèse (inférieur à deux), la numération de plaquettes (supérieure à 150 X 109/L) et de leucocytes (supérieure à 1 X 109/L) et l’absence de radiothérapie dans les antécédents.

Des études randomisées ont comparé les greffes de CSH et les greffes de moelle osseuse sur la cinétique de reconstitution hématopoïétique.

Les résultats montrent que les CSH sanguines permettent une reconstitution plus rapide des neutrophiles et une moindre consommation des produits sanguins, tels les concentrés de globules rouges ou de plaquettes. Pour la reconstitution plaquettaire, les résultats sont plus contradictoires.

Le nombre de cellules CD34+ injectées a une influence incontestable sur la vitesse de reconstitution de l’hématopoïèse.

B - Cryoconservation des cellules souches hématopoïétiques :

Elle repose classiquement sur la méthode de descente en température contrôlée et la conservation en azote liquide ou gazeux. Récemment, une méthode simplifiée a été proposée.

Elle consiste à utiliser du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5 %comme cryoprotecteur et une congélation directe dans un congélateur mécanique à - 80 °C.

Le rendement des cellules mononucléées est de 90 % et celui des progéniteurs myéloïdes de 80 %.

En l’absence de lavage, cette méthode diminue la quantité de DMSO injectée au patient (intérêt notamment en pédiatrie).

Cependant, à cette température, la durée de conservation ne peut dépasser 6 mois.

En revanche, en azote liquide (-196 °C), la durée de conservation pourrait atteindre plusieurs dizaines d’années.

Il a été montré que les cellules CD34 autologues peuvent être sélectionnées à partir d’un matériel cryoconservé, mises en expansion ex vivo et réinjectées, sans induire de phénomènes d’intolérance, à des patients ayant subi une chimiothérapie.

La cinétique de reprise de l’hématopoïèse est similaire à celle d’un groupe témoin.

C - Maladie résiduelle :

Pour le suivi de la maladie résiduelle (MR), les principales technologies utilisées sont de trois types.

1- Techniques cytogénétiques :

Celles-ci présentent l’avantage d’une grande spécificité : la détection du marqueur clonal est sans ambiguïté, avec une appréciation des métaphases pathologiques résiduelles.

Mais ces techniques n’analysent que le compartiment minoritaire des cellules en cycle, d’où une faible sensibilité (10-2).

Elles sont le plus souvent utilisées dans les LMC pour une évaluation quantitative de la cinétique de décroissance du chromosome Philadelphie (Ph1).

Les techniques d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) améliorent les conditions de détection des anomalies chromosomiques.

La technique FISH est quantitative, elle permet l’analyse de l’ensemble des cellules en métaphase et en interphase.

2- Immunophénotypage et cytométrie de flux :

Il n’existe pas, en règle générale, d’antigène spécifique du caractère tumoral, en dehors d’antigènes de protéines chimériques produits par des réarrangements.

La caractérisation des cellules leucémiques repose sur la mise en évidence par de multiples marquages de phénotypes aberrants.

Dans les leucémies lymphoblastiques de la lignée B, des phénotypes aberrants se voient dans le tiers des cas.

Dans les LAM, ils ont été observés dans 85 %des cas.

La cytométrie est une technique relativement sensible, qui analyse un grand nombre de cellules, détectant jusqu’à 1 cellule anormale sur 10 000.

Cependant, elle ne permet pas, à elle seule, de diagnostiquer et suivre la MR.

3- Biologie moléculaire :

Elle repose sur l’amplification génique in vitro ou polymerase chain reaction (PCR).

Elle a deux applications principales :

– dans les hémopathies malignes où existe une translocation avec la formation d’un gène de fusion, celui-ci est une cible privilégiée pour les techniques de PCR ;

– dans les pathologies malignes du système lymphoïde, les réarrangements des gènes des immunoglobulines ou du récepteur T, au niveau de l’acide désoxyribonucléique (ADN) génomique,, sont des marqueurs de clonalité.

Les techniques de RT-PCR (PCR avec transcriptase inverse : reverse transcription-polymerase chain reaction) visent à détecter les acides ribonucléiques (ARN) messagers.

Elles ont des facteurs limitants, telle la fragilité du matériel de départ et un champ d’application restreint aux pathologies comportant des marqueurs analysables (une leucémie aiguë sur trois).

La très grande sensibilité de la PCR s’accompagne d’un risque de faux positifs.

4- Indications et intérêt :

La diversité des marqueurs utilisables dans le suivi des hémopathies est telle qu’il est devenu possible de suivre la plupart des LAL et quelques leucémies myéloïdes.

Dans les protocoles d’autogreffe, le suivi de la MR est essentiel.

Il réclame une réponse quantitative, avec la technique la plus sensible possible, pour analyser le greffon et suivre le patient, après le conditionnement et la transfusion du greffon de CSH autologues.

Dans les lymphomes malins non hodgkiniens (LMNH), les résultats à long terme, en termes de survie sans maladie, sont significativement meilleurs si la maladie résiduelle est indétectable dans le greffon.

D - Traitement ex vivo des greffons de cellules souches hématopoïétiques :

1- Traitement chimique :

La toxicité hématologique est une conséquence majeure des chimioradiothérapies responsables d’une déplétion du compartiment des CSH.

Le rationnel du traitement ex vivo d’un greffon de CSH médullaires ou sanguines est fondé sur une différence de sensibilité aux agents chimiothérapiques entre les progéniteurs normaux et leucémiques.

Le traitement ex vivo du greffon de CSH avec des dérivés du cyclophosphamide, tel le 4-hydroperoxy-cyclophosphamide (4-HC) ou le mafosfamide, a été utilisé pour réduire, voire éliminer, les cellules leucémiques résiduelles qui contaminent le greffon autologue.

Cependant, les progéniteurs hématopoïétiques et les cellules leucémiques possèdent une sensibilité similaire au 4-HC ou au mafosfamide.

Or, il existe une relation inverse entre le pourcentage des CFU-GM viables (colony forming unitgranulocyte macrophage) et le délai de prise de greffe.

Une purge chimique doit diminuer d’au moins six logs le nombre de cellules leucémiques, tout en préservant un nombre de CSH compatible avec une prise de greffe.

Aux doses de mafosfamide habituellement utilisées, on observe plus de 95 % de destruction des progéniteurs différenciés (CFU-GM, BFU-E).

Il s’ensuit une reconstitution hématologique retardée, associée à un risque plus élevé d’infection, une prolongation de l’hospitalisation et un support transfusionnel plus important.

L’amifostine (Ethyolt), composé développé initialement comme agent radioprotecteur, protège de façon sélective les cellules médullaires normales de la toxicité induite par les agents chimiothérapiques, sans interférer avec leur activité antitumorale.

Elle a ainsi été utilisée in vitro pour améliorer l’efficacité du traitement, tout en diminuant la toxicité pour les progéniteurs.

2- Traitement immunologique :

L’absence d’antigènes spécifiques du caractère tumoral et la réduction tumorale modeste (deux à trois logs) ne sont pas compatibles avec une stratégie pertinente de purge immunologique (anticorps monoclonaux + complément, immunotoxines, etc).

Il est possible de séparer les cellules CD34+ normales, par une sélection positive, des cellules tumorales contaminantes.

Cette méthode ne peut être appliquée qu’aux hémopathies CD34-.

Les leucémies aiguës en sont exclues, en revanche, le doute subsiste sur l’application possible de ce type de sélection dans les pathologies lymphoïdes, telles que le lymphome folliculaire ou le myélome multiple, puisque leur origine n’a pas été clairement démontrée.

L’efficacité d’une sélection positive varie de trois à quatre logs de déplétion des cellules « pathologiques », mais le rendement final en cellules CD34, avec les systèmes classiques de tri, ne dépasse pas 60 %.

Avec un nouveau système de tri immunomagnétique, le rendement et la purification en cellules CD34+ peuvent atteindre respectivement 80 %et 90 %.

Une sélection négative (agent chimique ou immunologique) peut être associée secondairement au tri de cellules CD34+, pour augmenter l’effet de purge des greffons autologues.

E - Expansion ex vivo :

Plusieurs méthodes ont été proposées ces dernières années, pour multiplier et/ou manipuler les CSH, afin d’en augmenter le potentiel thérapeutique et/ou la rapidité de reconstitution hématopoïétique.

Grâce aux biotechnologies qui ont permis de produire une large gamme de cytokines hématopoïétiques, contrôlant la prolifération et la différenciation des CSH, le principe des manipulations ex vivo de l’hématopoïèse est du domaine du possible.

Plusieurs tests in vitro permettent de quantifier les progéniteurs différenciés et les cellules souches plus primitives.

Mais pour évaluer les cellules souches dites primitives, on fait appel à l’étude de leur capacité de reconstitution hématopoïétique in vitro (technique des cultures à long terme) ou in vivo à l’aide du modèle des souris non obese diabetic/severe combined immunodeficiency mice (NOD/SCID) permettant de quantifier les SCID repopulating cells (SRC).

Il s’agit d’un modèle intéressant mais complexe et non standardisé.

La génération ex vivo de CSH capables de reconstituer une hématopoïèse à long terme dépend de la source de CSH (moelle osseuse versus sang périphérique), de l’utilisation d’un greffon purifié ou non en cellules CD34+ et du type de culture ex vivo.

L’expansion ex vivo de cellules CD34+ autologues peut être combinée avec des stratégies de purge de cellules leucémiques.

Les données préliminaires démontrent la possibilité d’utiliser des CSH cultivées, dans le but de réduire, et peut-être d’abolir l’aplasie induite par les hautes doses de chimiothérapie.

Dans un premier temps, les CSH sont purifiées en sélectionnant les cellules CD34+, afin d’éliminer les cellules accessoires, dont l’activité inhibitrice est capable de limiter le degré d’expansion ex vivo.

L’objectif est d’obtenir à la fois des progéniteurs différenciés et des cellules matures fonctionnelles, capables de prévenir à court terme les complications infectieuses et hémorragiques et des CSH primitives, non différenciées, pour assurer une hématopoïèse durable et de qualité.

Une étude récente, ne portant, il est vrai, que sur une cohorte limitée de sept patients, a montré que des cellules CD34+ cultivées pendant 10 jours, en présence d’un cocktail de trois cytokines (SCF, G-CSF et MGDF), pouvaient réduire, de façon très significative, la durée de la neutropénie et de la thrombopénie induites par une chimiothérapie myéloablative.

Dans certaines conditions de culture, il est possible d’obtenir des progéniteurs mégacaryocytaires avec un pic de prolifération au 7e jour de la culture.

La réinjection chez le malade de ces progéniteurs générés ex vivo est bien tolérée et pourrait réduire, voire supprimer, le support transfusionnel plaquettaire postgreffe.

F - Thérapie cellulaire hématopoïétique autologue et enjeu de sécurité sanitaire :

La plupart des procédés dits de thérapie cellulaire ne sont pas strictement validés.

Les CSH médullaires, sanguines et autologues représentent l’activité de thérapie cellulaire la plus importante (2 155 malades en France en 1996 contre 1 240 en 1992).

La maîtrise des méthodes de contrôle de qualité et leur standardisation n’ont pas suivi la rapide évolution des thérapies cellulaires.

Il n’existe pas de consensus sur le contrôle de qualité des produits tels que les CSH.

Il existe, en effet, une grande variabilité d’un laboratoire à l’autre, d’où la difficulté de définir un produit de CSH destiné à la greffe.

Pour la seule numération des cellules CD34+, un protocole de standardisation a été publié récemment par l’International Society for Hematotherapy and Graft Engineering (ISHAGE) qui définit tous les paramètres intervenant dans la quantification des cellules CD34+.

La démarche de validation d’une technique de laboratoire pour le contrôle de la qualité doit s’inscrire dans le cadre des bonnes pratiques de laboratoires, intégrées dans une stratégie plus générale des bonnes pratiques de fabrication.

Le prélèvement de CSH s’inscrit dans des stratégies innovantes qui se multiplient et qui font appel à des techniques réalisées dans des conditions (locaux, équipement, contrôles) parfois contestables.

Les réactifs utilisés dans les manipulations cellulaires ex vivo n’ont pas toujours les prérequis nécessaires réclamés aux produits « ancillaires » utilisés pour la préparation des produits cellulaires.

La qualification, pour usage thérapeutique, de ces produits dépend de l’Agence de sécurité sanitaire (loi du 1er juillet 1998), dont le rôle est important dans cette nécessaire évolution.

Si la thérapie cellulaire, pratique médicale innovante, est née dans le secteur public et transfusionnel, un partenariat avec l’industrie privée est nécessaire, pour l’aide à la mise en place des bonnes pratiques de fabrication.

Un arrêté, daté du 16 décembre 1998, portant homologation des règles des bonnes pratiques relatives aux prélèvements, transformations et conservations des CSH, a été publié au JO le 30 décembre 1998.

Indications et résultats de l’autogreffe de cellules souches hématopoïétiques :

A - Indications et résultats chez l’adulte :

1- Autogreffe de cellules souches hématopoïétiques et leucémies :

De nombreuses études cliniques de phase II ont été réalisées dans les années 1980 et 1990.

Les résultats d’études prospectives randomisées, en particulier dans les LAM, permettent de considérer l’autogreffe comme un traitement de référence chez l’adulte.

2- Leucémie aiguë myéloblastique :

Pour les adultes jeunes, plusieurs études randomisées ont été publiées, comparant l’intensification suivie d’autogreffe de CSH à des protocoles de chimiothérapie de référence chez les patients en première rémission.

Les résultats de ces études sont toutefois discordants : dans l’étude EORTCGIMEMA, la survie sans rechute dans le groupe autogreffe est supérieure à celle du groupe chimiothérapie, (48 % plus ou moins 5 %, contre 30 % plus ou moins 4 %) sans différence au niveau de la survie globale, en raison des possibilités de traitement de seconde ligne chez les patients ayant rechuté après chimiothérapie.

L’étude du BGMT(Bordeaux-Grenoble-Marseille-Toulouse), plus ancienne, est également en faveur du groupe autogreffe mais avec des résultats de chimiothérapie plus mauvais que dans les autres essais de phase III et avec un plus faible nombre de patients.

Dans l’étude du MRC (Medical Research Council), la survie sans rechute est également supérieure à celle obtenue par la chimiothérapie (53 % contre 40 %).

En revanche, dans les études du GOELAMS (Groupe Ouest-Est pour les leucémies aiguës) et de l’intergroupe ECOG-SWOG-CALGB, les résultats de l’autogreffe et de la chimiothérapie ne sont pas statistiquement différents (taux de survie sans maladie de 47 % pour le GOELAMS, 35 % pour l’intergroupe).

Ces discordances sont liées à des schémas thérapeutiques variés, aux différences portant sur la proportion des patients ayant effectivement reçu le traitement assigné par la randomisation, mais aussi aux délais entre la date de rémission et le moment de la greffe, avec pour certains, des chimiothérapies intensives préalables.

De plus, le type de conditionnement n’était pas homogène d’une étude à l’autre (cyclophosphamide versus cyclophosphamide-ICT en particulier).

À ce jour, aucune étude randomisée n’a fait la preuve de l’intérêt du traitement ex vivo du greffon et il ne semble pas exister de différence selon la source de CSH utilisée (moelle versus CSH).

Par ailleurs, rien ne permet d’affirmer une différence en termes d’efficacité ou de majoration de toxicité entre cyclophosphamide-ICT et busulfan-cyclophosphamide.

Quel que soit le traitement, la mortalité liée à la greffe se situe entre 5 et 15 %.

Enfin, des études pilotes sont en cours afin d’évaluer la faisabilité et l’efficacité des autogreffes de CSH dans les myélodysplasies à haut risque.

3- Leucémie aiguë lymphoblastique :

Seule une étude prospective randomisée a été publiée par le groupe français, comparant l’intensification suivie de greffe de moelle purgée à un schéma de chimiothérapie consistant en huit cycles d’un protocole proche du schéma « L10 » de l’équipe du Memorial de New York.

Les résultats de cette étude (LALA 87) sont équivalents en termes de survie sans rechute à 3 ans (39 % pour le groupe autogreffe versus 32 % pour le groupe chimiothérapie) mais seulement 66 % des patients affectés au groupe autogreffe ont été greffés.

Pour les patients effectivement autogreffés en première rémission complète (RC), le taux de survie sans maladie à 3 ans était de 51 %.

Les données de suivi publiées plus de 1 an après ne montrent pas de différence de survie entre les deux groupes, même après stratification par facteurs de risque.

Dans l’étude du groupe EBMT, le taux de survie sans rechute est de 40 % en première RC et de 20 %en deuxième RC.

Le rôle du traitement ex vivo n’est pas prouvé à ce jour, bien que les cellules leucémiques résiduelles du greffon puissent être identifiées à la rechute.

Enfin, l’étude du BGMT avec l’interleukine 2 après autogreffe n’a pas montré d’effet bénéfique en termes de taux de rechute.

L’ensemble des résultats est caractérisé par un taux de mortalité lié à la procédure d’environ 5 %, la rechute demeurant la cause majeure d’échec du traitement.

Le taux de survie sans maladie est variable ; il se situe entre 32 et 75 % selon les études, essentiellement en raison des différences de population des patients sélectionnés.

Pour les LAL à très haut risque, LAL Ph1+ en particulier, il semblerait que l’autogreffe purgée soit supérieure à la chimiothérapie, avec toutefois un risque très élevé de rechute.

Ces traitements sont en cours d’évaluation chez les patients de plus de 50 ans, voire plus de 60 ans, soit en première RC, soit en traitement de seconde ligne en deuxième RC avec des schémas de conditionnement éventuellement allégés.

Dans les groupes ayant abandonné l’autogreffe en première ligne, celle-ci est réalisée comme intensification du traitement de rattrapage.

Les résultats actuels des autogreffes en deuxième RC font état d’environ 20 à 30 % de survivants à long terme.

En dépit de nombreuses tentatives, aucun conditionnement n’a fait la preuve de sa supériorité par rapport à l’association cyclophosphamide-ICT.

Toutefois, selon des essais non randomisés, les hautes doses d’Étoposidet pourraient permettre de diminuer les rechutes.

4- Leucémie myéloïde chronique :

Pour les patients dépourvus de donneur HLA identique, le traitement de référence est actuellement l’interféron associé à l’Ara-C, avec une survie à 3 ans de 85,7 %.

Toutefois, le taux de rémission cytogénétique ou mieux, moléculaire, reste faible.

Il est cependant possible de négativer le chromosome Philadelphie (Phi) par une chimiothérapie intensive incluant l’autogreffe.

L’utilisation de l’interféron alpha permet d’obtenir des réponses cytogénétiques et les cellules Phi-négatives peuvent être identifiées in vitro et proliférer plus rapidement en culture que les cellules Phi-positives.

Ces propriétés cinétiques différentes peuvent être utilisées dans le contexte des autogreffes.

Différentes études pilotes sont encourageantes, telle l’étude de Carella, où 62 % des patients ont eu, après mobilisation de CSH sanguines, un produit de leukaphérèse Phi-négatif.

Les résultats en phase chronique, quelles que soient les techniques utilisées, sont encourageants avec un taux très faible de mortalité et un bénéfice thérapeutique apparent.

Seules les études randomisées en cours, en France et en Europe, permettront de situer la place de l’autogreffe par rapport au traitement conventionnel.

5- Leucémie lymphoïde chronique :

Des études pilotes sont en cours dans les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC), en première ligne ou en rechute.

L’absence de recul d’une part, la sélection des patients d’autre part, ne permettent pas encore de situer la place de l’intensification et du traitement ex vivo éventuel dans l’arsenal thérapeutique des LLC.

Dans l’analyse intermédiaire d’une étude de phase II du groupe GOELAMS, 16 patients sur 22 sont en RC, dont 4 à 43 mois après la greffe.

Des études randomisées sont en cours, afin de comparer l’efficacité de cette approche dans les stades B et C de Binet, par rapport aux chimiothérapies conventionnelles.

6- Autogreffe de cellules souches hématopoïétiques et myélome :

Deux études randomisées françaises ont été publiées afin de comparer, dans le myélome, l’intensification suivie d’autogreffe à une chimiothérapie conventionnelle.

Les essais de phases II ont permis d’évaluer le taux de réponse de 20 à 50 % de RC apparente, soit un bénéfice incontestable par rapport à la chimiothérapie.

L’étude de phase III de l’Intergroupe français du myélome (IFM) a permis de confirmer cette impression chez 200 patients intensifiés en première ligne.

L’étude du groupe Myélome autogreffe s’est focalisée sur la période optimale de l’intensification (précoce ou tardive, en traitement de seconde ligne).

La survie des deux groupes était identique avec une médiane supérieure à 5 ans.

Aucune de ces deux études ne montre d’évolution des courbes de survie vers un plateau.

Des traitements séquentiels sont à l’étude.

Le protocole IFM 94, comparant la simple et la double autogreffe, ne montre un bénéfice de la double greffe que pour les patients ayant un taux faible de â2 microglobuline (82 % de survie à 3 ans pour la double greffe, 65 % pour les patients traités par simple greffe).

Le greffon de CSH améliore indiscutablement la tolérance de la greffe et les conditionnements les plus utilisés sont soit le melphalan seul à haute dose, soit l’association melphalan-ICT.

7- Autogreffe de cellules souches hématopoïétiques et lymphome non hodgkinien :

La deuxième Conférence internationale de consensus sur le traitement des lymphomes agressifs par chimiothérapie à forte dose, suivie d’autogreffe de CSH a permis de définir les indications et les modalités des traitements pour certaines indications ayant fait l’objet d’un consensus.

Pour les rechutes chimiosensibles, l’étude Parma a permis de retenir l’autogreffe comme traitement de référence, avec une survie sans événement à 5 ans de 46 % contre 12 % pour la chimiothérapie conventionnelle.

Par ailleurs, le délai de survenue de la rechute et l’index pronostique international (IPI) évalué lors de la rechute sont des éléments prédictifs de la survie.

Les rechutes réfractaires n’ont pas été retenues comme indication.

L’étude du groupe d’étude des lymphomes de l’adulte (GELA) a démontré par ailleurs l’intérêt d’une chimiothérapie de rattrapage avant l’intensification, car les malades greffés d’emblée ont une survie sans événement de 21 %à 2 ans contre 38 % pour ceux qui ont bénéficié d’une chimiothérapie préalable (p = 0,01).

L’intensification en première ligne a fait l’objet de plusieurs études randomisées de phase III, dont les résultats restent encore contradictoires.

Les stratégies sont toutefois différentes en ce qui concerne la durée des chimiothérapies conventionnelles préalables à l’intensification.

L’étudeLNH 87 du GELA a montré un bénéfice de l’autogreffe pour les patients ayant un score IPI élevé à 2-3 avec une survie sans rechute de 59 %à 5 ans contre 39 % pour la chimiothérapie (p = 0,01).

L’analyse intermédiaire du groupe GOELAMS et celle du groupe allemand ne retrouvent pas de différence.

La réponse incomplète au traitement ne semble pas, avec les données actuelles, être une indication suffisante d’intensification avec autogreffe.

Il n’existe actuellement pas de données permettant de privilégier un protocole de conditionnement.

Le plus utilisé en France et en Europe est la polychimiothérapie de type BEAM (cermustine, étoposide, cytarabine, melphalan).

L’autogreffe de CSH est actuellement la référence en raison du raccourcissement de l’hospitalisation et d’un moindre coût.

Il n’y a pas d’indication de traitement ex vivo en dehors d’essais randomisés.

La place d’une radiothérapie complémentaire reste à évaluer, de même que l’association à des anticorps monoclonaux, radiomarqués ou non.

La mortalité liée au traitement est d’environ 3,5 %pour les autogreffes de CSH.

Pour les lymphomes folliculaires et les lymphomes du manteau, des études de phase II sont encourageantes. Pour les lymphomes folliculaires, des études randomisées sont en cours, avec un traitement du greffon, compte tenu des résultats intéressants obtenus par l’équipe de Boston.

8- Autogreffe de cellules souches hématopoïétiques et maladie de Hodgkin :

L’intensification est utilisée depuis une quinzaine d’années, sans consensus clair entre les différents groupes sur ses indications précoces en première rémission, en raison des risques de complications à long terme.

La comparaison entre l’intensification suivie d’autogreffe de CSH et la chimiothérapie conventionnelle, chez les patients en échec précoce, a été publiée récemment par la Société française de greffe de moelle.

Parmi les 86 patients étudiés dans le groupe autogreffe, 91 % avaient une maladie en progression et 9 % une réponse partielle de courte durée.

Le seul facteur pronostique mis en évidence pour la survie était la réponse au traitement de rattrapage (répondeurs : risque relatif = 2,8, p = 0,017 ; maladie progressive : risque relatif = 5,26, p < 0,001).

La probabilité de survie à 5 ans après greffe, était de 35 %, de 25 % pour la survie sans événement.

Sept patients (8,1 %) sont décédés des complications liées au traitement, dont trois en maladie progressive au moment du traitement.

Ces résultats ont été comparés à une population témoin traitée par chimiothérapie conventionnelle (trois patients témoins pour une greffe).

La probabilité de survie à 6 ans du diagnostic était de 38 % pour le groupe autogreffe contre 29 % pour le groupe témoin (p = 0,058).

L’intensification reste la meilleure option thérapeutique pour les patients en échec d’induction.

Les conditionnements les plus utilisés sont le BEAM et le CBV (cyclophosphamide, carmustine, étoposide).

Parmi ces patients, 37 % ont reçu une irradiation après la greffe. Pour les patients en rechute, les taux de survie sans progression se situent entre 40 et 64 %à 4 ans, les résultats sont meilleurs en cas de rémission supérieure à 1 an.

La place de l’intensification précoce en première rémission est encore à l’étude pour certains patients à haut risque.

Le rôle d’une radiothérapie complémentaire ou de l’utilisation d’anticorps radiomarqués est à l’étude.

B - Indications et résultats de l’autogreffe de cellules souches hématopoïétiques chez l’enfant :

1- Leucémie aiguë lymphoblastique :

Les protocoles actuels de chimiothérapie de première ligne ont permis d’améliorer nettement le pronostic des LAL de l’enfant puisque 70 à 75 % des enfants peuvent être considérés comme guéris.

Néanmoins, près de 25 % des enfants vont rechuter, soit dans la moelle osseuse, soit dans des sites extramédullaires.

Une chimiothérapie intensive permet d’obtenir une deuxième rémission complète dans 80 à 90 % des cas, mais la survie à long terme reste néanmoins mauvaise : elle est de l’ordre de 5 à 10% pour les enfants qui rechutent moins de 18 mois après le diagnostic, et de 25 à 40 % si la rechute survient plus tardivement, en l’absence de greffe de CSH.

Le pronostic est meilleur pour les rechutes extramédullaires isolées et en particulier pour les rechutes testiculaires tardives.

Dans certaines formes très péjoratives de LAL, certains auteurs ont proposé de réaliser une greffe autologue en première rémission complète : il s’agit soit de LAL chimiorésistante au traitement d’induction, soit de LAL avec une translocation (4 ; 11) ou (9 ; 22).

Le pronostic de ces formes est très mauvais malgré des traitements intensifs et la survie à 3 ans pour ces enfants ne dépasse pas habituellement 10 à 15 %.

Dans la série de l’EBMT, 61 enfants ont été autogreffés en première RC et le taux de survie sans leucémie atteint 46 % à 3 ans.

La majorité des greffes autologues chez l’enfant sont réalisées en deuxième RC en l’absence de donneur géno-identique intrafamilial.

Les greffes génoidentiques donnent des résultats généralement meilleurs que les greffes autologues, bien que certaines séries récentes comparant les survies d’enfants autogreffés et allogreffés rapportent des résultats similaires.

Certaines grandes séries, souvent rétrospectives, rapportent les résultats d’autogreffes chez les enfants en troisième RC ou en phase évolutive.

Les résultats les plus intéressants sont uniquement observés dans les rechutes extramédullaires, mais globalement, la survie sans événement (SSE) ne dépasse pas 15 à 20 % avec un recul moyen de 3 ans.

La deuxième RC demeure le moment privilégié pour la réalisation d’une autogreffe.

L’analyse des principales séries pédiatriques d’autogreffes en deuxième RC montre que la SSE, après rechute médullaire isolée ou combinée, se situe entre 18 et 50 %.

Les facteurs susceptibles d’influencer la survie à moyen et à long terme sont les conditionnements prégreffe comprenant une ICT et la durée de la première RC.

La plus large série publiée actuellement est une étude rétrospective de l’EBMT qui porte sur 177 enfants autogreffés en deuxième RC.

Il faut souligner dans cette étude que plus de 75 % des enfants avaient été conditionnés par une association de cyclophosphamide (120 mg/kg en dose totale) et une ICT le plus souvent fractionnée (12 Gy en 6 fractions) alors que d’autres conditionnements renforcés associaient de hautes doses de cytarabine, d’étoposide, et/ou de melphalan.

Pour les enfants de moins de 4 ans, l’ICT était remplacée par du busulfan à des posologies comprises entre 16 et 20 mg/kg (16 prises en 4 jours).

Les décès d’origine toxique dans cette série étaient directement liés à l’importance du conditionnement et essentiellement dus à des complications infectieuses ou à une maladie veinoocclusive, principalement chez des enfants recevant du busulfan à haute dose.

Les décès d’origine toxique représentent actuellement moins de 10 % de l’ensemble des observations et surviennent essentiellement au cours des 3 premiers mois.

La cause la plus fréquente d’échec dans les greffes autologues est la rechute de la maladie initiale qui survient dans 35 à 80 % des observations et est directement corrélée à la durée de la première RC.

Si celle-ci est supérieure à 24 mois, le pronostic est le meilleur selon la série publiée par Billett.

Cet auteur rapporte une SSE à 53 plus ou moins 7 % à 3 ans, si la première RC a duré plus de 24 mois et même une SSE à 81 plus ou moins 13 % pour les 13 enfants dont la première RC avait supérieure à 48 mois. Le délai entre l’autogreffe et la rechute est habituellement court, entre 3 et 6 mois, et la majorité des rechutes surviennent dans les 24 premiers mois.

Un autre facteur pronostique est l’intervalle séparant l’obtention de la deuxième RC de l’autogreffe, avec une survie meilleure pour les enfants pour lesquels cet intervalle dépasse 13 semaines.

Une étude multicentrique concernant 552 observations d’enfants autogreffés dans 17 centres différents montre qu’avec des greffons purgés, soit par anticorps monoclonaux et complément, soit par des dérivés du cyclophosphamide, le taux de survie sans rechute se situe entre 25 et 30 %.

En ce qui concerne l’efficacité de la purge du greffon médullaire, aucun essai prospectif ou randomisé n’a été réalisé.

Les séries publiées donnent des résultats contradictoires et il n’est pas possible de démontrer l’efficacité d’une quelconque technique de purge dans la LAL.

En 1998, Messina a actualisé les résultats du groupe AIEOP concernant les autogreffes dans les LAL de l’enfant, portant sur 154 enfants enregistrés de 1984 à 1994 : 98 enfants étaient en deuxième RC et 56 en maladie plus évoluée.

La SSE à 8 ans était de 34,6 et 10,6 % respectivement.

Les facteurs pronostiques étaient :

– le site de la rechute, avec un meilleur pronostic pour les rechutes extramédullaires isolées (SSE à 68,5 % pour les 33 enfants autogreffés en deuxième RC) ;

– les conditionnements incluant une ICT.

En ce qui concerne les rechutes extramédullaires isolées, les résultats récemment publiés confirment les données antérieures, en particulier dans les rechutes isolées du système nerveux central : pour 19 enfants ayant bénéficié d’une autogreffe en deuxième RC, le taux de survie sans récidive à 5 ans est de 56,3 % contre seulement 12,6 %pour les enfants ayant été traités par chimiothérapie sans consolidation.

Les rechutes testiculaires isolées, devenues très rares avec les nouveaux protocoles de première ligne, ne concernent que quelques malades et les résultats sont satisfaisants.

En 1995, le groupeBFMa comparé les résultats des greffes autologues à ceux de la chimiothérapie pour des enfants en deuxième RC, en appariant 52 malades dans chaque groupe.

Le taux de SSE à 9 ans était de 32 %dans le groupe chimiothérapie contre 26 % pour les enfants autogreffés.

La greffe autologue n’apporte aucun avantage significatif et ce groupe pose le problème d’une immunothérapie ou d’une chimiothérapie après greffe, étant donné l’absence d’effet greffon-contre-leucémie.

L’autogreffe de CSH dans les LAL de l’enfant à haut risque donne des résultats voisins de ceux obtenus par les autres équipes avec un greffon médullaire, confirmant un meilleur pronostic dans les rechutes tardives.

2- Leucémie aiguë myéloïde :

Le pronostic des LAM de l’enfant s’est lui aussi nettement amélioré ces dernières années, avec une SSE comprise entre 40 et 60 %, en particulier chez les enfants qui ne présentent pas de critères de mauvais pronostic au diagnostic.

Si l’indication de greffe géno-identique est retenue par la majorité des auteurs, la greffe autologue reste discutée, en particulier en première RC, même si certaines études montrent une meilleure survie chez les enfants autogreffés par rapport à ceux traités par chimiothérapie.

Certains auteurs constatent une survie identique chez les enfants ayant reçu une greffe géno-identique et chez les enfants traités par autogreffe en première RC purgée par le 4-HC.

La survie sans rechute est de 51 % à 3 ans.

L’étude rétrospective de l’EBMT faisait état d’une survie sans rechute de 44 % à 5 ans, pour 98 enfants autogreffés en première RC, avec un meilleur pronostic pour les enfants ayant reçu un greffon purgé.

Le conditionnement prégreffe dans les LAM associe le plus souvent du busulfan (16 mg/kg) et du cyclophosphamide (200 mg/kg).

Ce conditionnement est moins toxique et comporte moins de séquelles à long terme que celui incluant une ICT.

L’étude de l’EBMT montre une survie sans rechute de 46 % à trois ans pour les enfants greffés en deuxième RC et des résultats identiques ont été retrouvés avec des greffons purgés par un dérivé de la cyclophosphamide.

Perspectives : immunothérapie et autogreffes de cellules souches hématopoïétiques

A - Rationnel :

Plusieurs éléments encouragent le développement de l’immunothérapie au décours d’une autogreffe de CSH pour hémopathie maligne.

La chimiothérapie intensive qui précède l’administration des CSH, en réduisant au maximum la charge tumorale, permet de se placer dans des conditions optimales de maladie résiduelle pour une immunothérapie complémentaire.

En outre, la reconstitution immunitaire dans les mois qui suivent l’autogreffe de CSH peut représenter une période privilégiée sur un plan immunologique, avec l’émergence et l’expansion de populations immunocompétentes telles que les cellules natural killer (NK) et/ou des lymphocytes T ne présentant pas un état d’anergie vis-à-vis des cellules tumorales résiduelles.

Enfin l’efficacité antileucémique majeure de l’effet greffon-contre-leucémie dans l’allogreffe de CSH a conduit de nombreuses équipes à essayer de reproduire cet effet allogénique dans le cadre de l’autogreffe de CSH.

B - Administration de cytokines :

L’administration d’interleukine–2 (IL-2) a fait l’objet de plusieurs études après autogreffe de CSH.

En effet, il a été démontré in vitro que les effecteurs immunologiques (lymphocytes T ou cellules NK) activés par l’IL-2 peuvent lyser des cellules malignes chimiosensibles mais aussi chimiorésistantes.

En outre, les effecteurs immunologiques sensibles à l’IL-2 sont présents précocement après autogreffe de CSH.

L’administration d’IL-2 après autogreffe de CSH est associée à une augmentation du nombre de lymphocytes T et NK circulants et à un accroissement de l’activité cytotoxique NK.

L’administration d’IL-2 est cependant susceptible d’engendrer une toxicité majeure (syndrome de fuite capillaire, toxicité hématologique), surtout si elle est administrée à forte dose.

Toutefois, l’efficacité de cette approche n’a pas été démontrée à ce jour, notamment dans le cadre de deux études randomisées évaluant la place de l’IL-2 après autogreffe de CSH pour leucémie aiguë.

Plusieurs études expérimentales suggèrent que l’incubation d’un greffon de CSH avec de l’IL-2 ex vivo, avant greffe, permet d’obtenir in vivo une activité cytotoxique importante vis-à-vis des cellules leucémiques résiduelles chimiorésistantes.

Chez l’homme, seule la faisabilité et la sécurité de cette approche ont été évaluées.

L’administration d’un facteur de croissance hématopoïétique tel le GM-CSF peut contribuer in vivo à l’activation d’effecteurs immunologiques non spécifiques et à la génération de cellules spécialisées dans la présentation d’antigènes : les cellules dendritiques.

Ces propriétés ont conduit à envisager l’utilisation du GM-CSF après autogreffe.

Les données disponibles sont préliminaires et ne permettent pas de se prononcer sur l’efficacité de cette approche.

C - Transfert d’effecteurs immunologiques :

Les études in vitro et in vivo chez l’animal ont démontré que les lymphocytes activés ex vivo par l’IL-2 (cellules de type NK capables de cytotoxicité non spécifique) étaient capables de cytotoxicité vis-à-vis de cellules malignes, indépendamment de leur chimiosensibilité.

Des études pilotes ont démontré qu’il était possible d’administrer ce type de cellules chez l’homme avec de l’IL-2 après autogreffe de CSH.

Néanmoins, la lourdeur des procédures de préparation de ces cellules, associée à un risque de toxicité importante, a limité le développement clinique de cette approche.

Plus récemment, la possibilité de développer ex vivo des lymphocytes T cytotoxiques (CTL), dirigés contre des antigènes viraux (CMV [cytomégalovirus], EBV) a permis d’envisager l’utilisation de CTL dirigés contre des antigènes tumoraux comme l’idiotype de l’immunoglobuline de surface d’un lymphome B ou la protéine P210 bcr/abl.

Ce type d’approche, qui semble présenter un potentiel important, est actuellement en cours d’évaluation après autogreffe de CSH.

Plusieurs équipes ont exploré la possibilité d’obtenir un effet antileucémique de nature allogénique après autogreffe de CSH.

Un nombre progressivement croissant de lymphocytes T allogéniques (le plus souvent provenant d’un donneur intrafamilialHLAsemi-identique) est administré après autogreffe de CSH.

Le délai après la greffe, ainsi que la quantité de lymphocytes T administrés sont des variables importantes qui conditionnent l’intensité de l’effet alloréactif.

Cette approche peut être extrêmement toxique avec survenue d’une maladie du greffon contre l’hôte, graft-versus-host disease (GvH) sévère, comprenant une aplasie médullaire semblable à celle observée dans une GvH post-transfusionnelle.

La possibilité de détruire in vivo ces lymphocytes T par l’expression d’un gène de toxicité conditionnelle, dit « suicide », permettra peut-être le développement de cette approche allogénique après autogreffe de CSH.

D - Induction d’un effet « greffon-contre-hôte » autologue après administration de ciclosporine :

Chez l’animal, l’administration de ciclosporine après greffe de moelle syngénique peut conduire au développement d’un syndrome auto-immun dont les caractéristiques cliniques et histologiques sont similaires à celles d’une GvH après greffe de CSH allogéniques.

Les mécanismes à l’origine de cet effet sont mal élucidés.

La ciclosporine interfère avec les processus de sélection négative intrathymique permettant l’expansion de clones lymphocytaires T autoréactifs.

L’expansion de ces clones serait rendue possible grâce à l’immunosuppression consécutive au conditionnement à la greffe.

Les mécanismes effecteurs de ce processus auto-immun sont encore moins bien connus.

Il semble que des peptides présentés par des molécules HLA de classe II soient les principales cibles de cette autoréactivité.

Cette approche a montré son efficacité dans plusieurs modèles animaux.

Les résultats d’études randomisées chez l’homme ne sont pas encore disponibles.

E - Approche vaccinale :

Des études in vivo ont démontré qu’une immunité antitumorale postvaccinale pouvait être transférée lors d’une autogreffe de CSH et que la reconstitution immunologique 2 à 5 semaines après greffe était compatible avec une immunisation antitumorale.

Un vaccin constitué de l’idiotype tumoral associé à un adjuvant (KLH) est en cours d’évaluation chez des patients atteints de lymphome de bas grade ou de myélome dans le cadre d’une autogreffe de CSH.

D’autres approches vaccinales, utilisant en particulier des cellules dendritiques ou des produits dérivés tels que les exosomes présentant des antigènes tumoraux, feront l’objet d’études de faisabilité après autogreffe de CSH dans un proche avenir.

Au total, l’hiatus entre le potentiel d’une immunothérapie après autogreffe de CSH et la démonstration effective de son efficacité clinique reste considérable.

La qualité de la reconstitution immunologique après autogreffe, la caractérisation des effecteurs immunologiques, les méthodes de préparation des vaccins antitumoraux et les modalités d’évaluation de l’immunité antitumorale sont des domaines où subsistent de nombreuses inconnues.

La réalisation d’études contrôlées de qualité devrait permettre de mieux cerner le type d’intervention immunologique présentant un potentiel thérapeutique dans le cadre de l’autogreffe de CSH.

L’autogreffe de CSH a une place dans l’arsenal thérapeutique dont nous disposons vis-à-vis de nombreuses hématopathies malignes.

Son efficacité dans certaines pathologies, parfois plus privilégiée que d’autres pour ce type d’approche, a été démontrée.

L’histoire des traitements ex vivo des greffons autologues, aura bientôt 20 ans.

Des centaines de travaux ont été publiés mais le doute subsiste sur sa réelle utilité, compte tenu de l’absence d’études randomisées.

Cependant, les études européennes rétrospectives ont régulièrement montré un avantage, en termes de survie sans maladie, pour les patients atteints d’une LAM, greffés avec des CSH traitées ex vivo par un dérivé du cyclophosphamide.

Que l’autogreffe de CSH, qui permet des intensifications thérapeutiques, soit suivie de rémissions prolongées avec une qualité de vie très satisfaisante, nul ne le conteste.

Le doute subsiste quant au degré de sa capacité réelle à guérir la maladie.

En cela, les perspectives de l’immunothérapie adoptive sont prometteuses.

Elles représentent la voie la plus crédible pour éliminer définitivement la maladie résiduelle indétectable.

Celle-ci peut, parfois plusieurs années après, à l’occasion peut-être d’une défaillance de la surveillance immunitaire, reprendre sa capacité de prolifération anarchique et conduire à la rechute.

Que pensez-vous de cet article ?

  Envoyer par mail Envoyer cette page à un ami  Imprimer Imprimer cette page

Nombre d'affichage de la page 9249

Copyright 2014 © Medix.free.fr - Encyclopédie médicale Medix