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Hématologie
Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire
Cours d'hématologie
 


 

Introduction :

Depuis la découverte de la structure en double hélice de l’acide désoxyribonucléique (ADN), il y a 40 ans, la biologie moléculaire a transformé notre capacité à caractériser les hémopathies malignes et à comprendre les processus qui les induisent.

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Grâce aux développements technologiques, la biologie moléculaire, d’abord cantonnée à la recherche, s’applique de plus en plus à l’évaluation biologique de malades atteints d’hémopathie maligne.

Ces techniques aident au diagnostic, à l’évaluation du pronostic et au suivi du malade après traitement.

Sur un plan plus fondamental, l’analyse structurale et fonctionnelle des gènes dérégulés dans les leucémies et les lymphomes a beaucoup amélioré notre compréhension des mécanismes, à la fois oncogénique et physiologique.

Techniques de base de la biologie moléculaire :

A - PRÉLÈVEMENTS :

Les acides nucléiques dans la cellule sont de deux types :

– l’acide désoxyribonucléique (ADN), enchaînement de 3 milliards de nucléotides chez l’homme répartis sur 46 chromosomes, appelé ADN génomique ;

– l’acide ribonucléique (ARN), lien entre le génotype (l’ADN) et le phénotype (la protéine).

Ces deux acides, même s’ils ne diffèrent que par l’absence d’un oxygène au niveau d’un sucre de l’ADN par rapport à l’ARN, n’ont pas les mêmes caractéristiques physicochimiques et ne donneront pas les mêmes informations en biologie moléculaire.

L’ADN et l’ARN sont extraits des cellules nucléées : un millilitre de sang contient en moyenne 30 à 50 µg d’ADN. L’ADN est relativement résistant, à la différence de l’ARN.

La qualité de l’extraction est importante pour la méthode de Southern (analyse de l’ADN génomique) et pour l’analyse de l’ARN.

B - ANALYSE DE L’ACIDE DÉSOXYRIBONUCLÉIQUE :

L’analyse de l’ADN en hématologie sert principalement à caractériser :

– soit des mutations ponctuelles ;

– soit des anomalies de structure : remaniements (translocations, réarrangements des gènes d’immunoglobulines ou du récepteur des cellules T) ou délétion ;

– soit des polymorphismes permettant l’analyse de la clonalité soit myéloïde, soit lymphoïde.

1- Méthode de Southern :

Quand une solution d’ADN est exposée à un pH ou une température élevée (90 °C), les deux brins complémentaires qui constituent l’ADN se séparent.

Ce phénomène, appelé dénaturation, est réversible, et la réassociation peut avoir lieu entre n’importe quel acide nucléique (ARN ou ADN) tant que les séquences sont complémentaires. Ceci est la base de la méthode décrite initialement par Edwin Southern en 1975.

L’ADN chromosomique est d’abord digéré par des enzymes de restriction qui coupent à des sites précis (comme EcoRI qui coupe entre le G et le A après avoir reconnu la séquence GAATTC) afin de diminuer la taille des fragments à analyser.

Ces fragments sont ensuite séparés selon leur taille par électrophorèse en gel d’agarose.

Les fragments d’ADN ainsi séparés sont transférés sur un support solide (nylon ou nitrocellulose) après une étape de dénaturation.

Une fois transférées, les séquences étudiées sont mises en évidence par hybridation d’une sonde préalablement marquée, radioactivement (phosphore 32) ou non (avec une perte de sensibilité dans ce dernier cas).

Après lavage, la membrane est mise au contact d’un film radiographique pour faire apparaître le signal de radioactivité.

Le fragment détecté est :

– soit de même taille et de même intensité que le témoin (par exemple ADN de placenta) : on parle de bande germinale, et comme l’ADN est diploïde (2n chromosomes), les deux allèles du même gène sont tous les deux sous forme germinale ;

– soit de même taille mais d’intensité réduite de moitié par rapport au témoin : dans ce cas, un des deux allèles est délété tandis que l’autre est toujours sous forme germinale ;

– soit de taille différente : on parle alors de bande réarrangée ;

– soit absence de bande en autoradiographie : les deux allèles du gène étudié sont délétés.

Cette méthode permet de connaître la structure des gènes.

Sa sensibilité est de l’ordre de 5 %, c’est-à-dire qu’elle peut détecter parmi la population cellulaire analysée des cellules ayant une modification génotypique présente dans au moins une cellule sur 20.

Cependant, elle ne permet pas de reconnaître les mutations ponctuelles, à l’exception des mutations affectant le site reconnu par l’enzyme de restriction nécessaire à la digestion de l’ADN.

2- Amplification en chaîne par une ADN polymérase thermostable (PCR) :

Cette méthode a révolutionné la biologie moléculaire des années 1990 et a été couronnée par l’attribution du prix Nobel de chimie en 1993.

Elle est basée sur l’amplification de fragments d’ADN délimités par deux courtes séquences reconnues par deux oligonucléotides, dites amorces, grâce à une ADN polymérase résistante à haute température (95 °C).

Il existe trois phases distinctes lors de l’amplification en chaîne par la polymérase (le sigle américain de cette méthode, PCR pour polymerase chain reaction, universellement connu, est utilisé dans le texte) :

– dénaturation : l’ADN est dénaturé par chauffage à haute température (95 °C), température à laquelle l’ADN polymérase résiste à la dégradation : les deux brins se séparent ;

– hybridation : la température de la solution est ramenée à une température de l’ordre de 50 à 60 °C, pour permettre à deux petits fragments d’ADN simple brin d’une vingtaine de bases (amorces), complémentaires de la région à amplifier et l’encadrant, de s’apparier à l’ADN génomique dénaturé (la distance entre les deux amorces peut varier entre une centaine de paires de bases et environ 2 kb en routine).

Ces amorces se fixent préférentiellement à la région à amplifier.

Elles sont nécessaires au fonctionnement du système car la polymérase ne peut initier d’elle-même la réplication, et apportent aussi la spécificité de la réaction ;

– élongation : la température est remontée à 72 °C, température optimale d’activité de l’ADN polymérase, enzyme extraite d’une bactérie thermophile isolée au niveau de geysers, Thermus aquaticus, à laquelle elle doit son nom : Taq polymérase.

Cette enzyme n’est pas dégradée par l’étape de dénaturation de 95 °C, à la différence des ADN polymérases qui avaient été préalablement utilisés.

La Taq polymérase copie l’ADN simple brin à partir des deux amorces.

Le fragment d’ADN compris entre les deux amorces s’est alors dupliqué.

Puis ces trois étapes (un cycle) sont répétées.

Après n cycles, le nombre de copies de la région amplifiée est théoriquement de 2n.

Ces cycles étant répétés habituellement 30 fois, on obtient en théorie 230 copies du gène initial, soit une amplification de l’ordre du milliard !

Le produit de l’amplification est ensuite visualisé sur un gel soit d’agarose, soit d’acrylamide (selon la taille du fragment amplifié), qui permet la résolution des fragments en fonction de la taille.

Plus récemment, l’utilisation d’amorces fluorescentes a permis d’améliorer la résolution de l’analyse du produit de PCR.

L’une des amorces (généralement l’antisens) est rendue fluorescente par la fixation, à son extrémité 5’, d’une molécule capable d’émettre une fluorescence de longueur d’onde déterminée après une excitation laser.

Par cette approche, le produit de PCR obtenu après amplification est détectable par la fluorescence émise lors du passage devant la fenêtre de lecture au cours d’une migration capillaire électrophorétique sur un analyseur de fragments.

Ceci permet de lui attribuer une taille précise, et améliore la sensibilité de détection du signal.

Plus généralement, la PCR apporte un énorme gain de sensibilité : le minimum nécessaire pour la méthode de Southern est de 5 µg, soit environ 750 000 cellules, tandis qu’avec la PCR on peut aller jusqu’à l’analyse d’une seule cellule.

Elle est donc particulièrement indiquée pour la détection de séquences très peu représentées, ou quand on dispose de peu de matériel pathologique.

Cette méthode possède de nombreux avantages par rapport à la méthode de Southern, d’où son utilisation plus fréquente en routine : rapidité (1 jour contre 1 semaine), sensibilité, possibilité d’analyser du matériel partiellement dégradé (ADN fixé) et absence de produits radioactifs.

Mais la sensibilité très élevée de cette méthode représente cependant un inconvénient majeur, le risque de faux positifs par amplification d’ADN présent comme aérosol dans le laboratoire, ou contaminant les échantillons à analyser, d’où la nécessité de travailler dans des conditions très rigoureuses permettant de rendre des résultats fiables.

3- Analyse des mutations :

Pour étudier les mutations ponctuelles pouvant affecter le fonctionnement des gènes, plusieurs méthodes peuvent être utilisées :

– l’établissement de la séquence des nucléotides constituant ce gène, méthode relativement lourde mais fiable ;

– deux autres méthodes indirectes de recherche de mutations ponctuelles, l’électrophorèse en gel de gradient dénaturant, et le polymorphisme conformationnel des structures simple brin.

* Séquençage :

La méthode décrite par Sanger est basée sur l’arrêt de l’élongation lors de la réplication par une ADN polymérase.

Cet arrêt est réalisé par la présence de didésoxynucléotides (ddNTP) qui, à la différence des désoxynucléotides (dNTP ou N signifie une des quatres bases) constituant l’ADN, ne permettent pas l’ajout de la base suivante lors de l’élongation car le radical hydroxyl nécessaire a été remplacé par un simple atome d’hydrogène.

En modifiant le ddNTP incorporé (par exemple ddATP au lieu de dATP) et en faisant migrer les quatre réactions d’élongation sur un gel de polyacrylamide permettant la résolution à une base près, on peut définir précisément l’enchaînement des nucléotides dans le gène étudié.

* Polymorphisme conformationnel des structures simple brin :

Cette méthode met à profit les différences de réappariement des molécules d’ADN simple brin sur elles-mêmes, aboutissant à une structure en épingle à cheveu, cette structure variant en fonction de la composition en nucléotides de l’ADN.

Ainsi, lors d’une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide non dénaturant, après dénaturation des deux brins de l’ADN à étudier, on observe une différence de migration non seulement selon leur taille mais aussi selon leur séquence, ce qui permet de distinguer un fragment d’ADN simple brin muté d’un fragment témoin, non muté.

* Électrophorèse en gel de gradient dénaturant :

Une des premières méthodes développées pour rechercher des mutations dans des régions étendues de l’ADN fut l’électrophorèse en gel de gradient dénaturant.

Cette technique est basée sur le fait que l’ADN simple brin migre beaucoup moins vite que l’ADN double brin.

Un ADN double brin contenant un défaut d’appariement (hétéroduplex réalisé in vitro entre un ADN simple brin muté et un ADN simple brin témoin) sera dénaturé plus rapidement qu’un ADN double brin parfaitement apparié.

En présence d’un gradient d’agent dénaturant (urée…), l’ADN mal apparié se dissocie plus rapidement, d’où un arrêt de sa migration plus précoce par rapport à l’ADN double brin témoin.

Une différence d’une seule base entre l’ADN muté et l’ADN témoin est suffisante pour provoquer des profils de migration différents.

4- Étude du polymorphisme :

Dans un certain nombre de cas, il est utile de distinguer les deux allèles d’un même chromosome, par exemple pour analyser la clonalité myéloïde, ou pour effectuer une étude de chimérisme postallogreffe.

Le polymorphisme étudié peut être de différents types :

– présence sur un allèle et absence sur l’autre d’un site de restriction.

En utilisant d’une part cette enzyme de restriction lors de l’analyse par la méthode de Southern, et d’autre part une sonde spécifique de cette région, il est possible de distinguer les deux allèles.

C’est le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP en anglais pour restriction fragment length polymorphism) ;

– le polymorphisme étudié peut provenir également d’une séquence répétée d’une manière différente sur chaque allèle (par exemple, 10 répétitions sur un allèle et 15 sur l’autre) analysé soit par la méthode de Southern, soit par PCR.

Ces séquences sont plus ou moins longues :

– de 11 à 60 nucléotides pour les minisatellites ou VNTR (variable number of tandem repeats), utilisées pour l’analyse du chimérisme postallogreffe ;

– de une à quatre bases pour les microsatellites ou STR (short tandem repeats), répétitions de 12 à 40 copies (application à la clonalité associée à l’inactivation aléatoire du chromosome, par exemple avec le gène du récepteur aux androgènes dont le microsatellite est représenté par la séquence CAG répétée de 12 à 26 fois).

L’informativité relative de ces polymorphismes est nettement plus importante pour les microsatellites et les minisatellites que pour les RFLP.

C - ANALYSE DE L’ACIDE RIBONUCLÉIQUE :

L’étude des produits de transcription permet la détection des ARN messagers normaux, ainsi que des ARN messagers de fusion résultant de translocations chromosomiques telle que bcr-abl, caractéristique de la leucémie myéloïde chronique.

L’étude de ces translocations est pratiquement impossible au niveau de l’ADN, car leurs points de cassure sont éparpillés sur les introns.

Lors de l’épissage des ARN messagers après transcription de l’ADN, les exons sont raboutés les uns aux autres, générant ainsi des ARN et des protéines de fusion uniformes.

La grande sensibilité de l’ARN vis-à-vis des ribonucléases, enzymes dégradant l’ARN et non l’ADN, présentes de manière ubiquitaire (mains…) et elles-mêmes résistantes à la dégradation, implique un soin particulier lors de sa manipulation.

1- Northern-blot :

Cette méthode permet d’étudier les produits de transcription, mais nécessite une trop grande quantité d’ARN pour être utilisée en routine.

Elle est fondée sur le même principe que celle développée par Edwin Southern, et elle fut dénommée par jeu de mots la méthode du Northern.

L’ARN est migré dans un gel d’agarose dénaturant (pour maintenir sa forme simple brin linéaire), puis il est transféré sur une membrane de nylon et hybridé avec une sonde radioactive, comme pour le Southern.

Un ARN de fusion n’aura pas la même taille que l’ARN messager sauvage.

Cette méthode permet une quantification de l’ARN messager d’une manière plus fiable que la RT-PCR (PCR après transcription inverse), mais avec une sensibilité moindre.

2- Dot-blot :

Cette méthode est une simplification de la méthode du Northern, qui permet la quantification des ARN messagers sans évaluer leur taille.

Elle ne distingue pas un ARN de fusion d’un ARN normal.

Une goutte d’ARN est directement déposée sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose (formant un petit disque sur cette membrane, d’où le nom anglais : dot = point).

La membrane est ensuite mise au contact de la sonde marquée, puis l’hybridation spécifique est révélée par autoradiographie.

3- RT-PCR :

L’étude des ARN de fusion est devenue très aisée avec l’apport de la PCR.

Cette méthode avait été initialement décrite pour l’ADN, mais une simple modification permet de l’utiliser aussi pour l’ARN.

Elle utilise une enzyme caractéristique des rétrovirus, la transcriptase inverse, une ADN polymérase ARN-dépendante, qui permet de copier, en présence d’une amorce, une molécule d’ARN simple brin en une molécule d’ADN simple brin complémentaire de la séquence de l’ARN messager.

Une fois cette molécule d’ADN complémentaire (ADNc ou cDNA) obtenue, la réaction classique de PCR peut être effectuée avec deux amorces spécifiques du gène à étudier.

D - MÉTHODES QUANTITATIVES : PCR EN TEMPS RÉEL

Cette technique récente mesure la cinétique de formation du produit d’amplification au cours de la réaction de PCR, sans l’interrompre, et en déduit une quantification de la cible dans l’échantillon analysé.

Elle peut s’appliquer aussi bien à l’analyse en RT-PCR qu’à l’analyse génomique sur matrice d’ADN.

Cette approche nécessite un marqueur fluorescent, dont le signal augmente de manière spécifique avec l’amplification au cours de la réaction de PCR, et un système de mesure externe de la fluorescence en temps réel.

Le module de détection fait appel à une excitation par laser ou diode de tungstène par des fibres optiques et la mesure de la fluorescence réémise par une caméra CDD à des intervalles très rapprochés au cours de la réaction de PCR.

Deux systèmes fluorescents sont disponibles :

– Sybr Green : agent intercalant qui émet une fluorescence lorsqu’il se fixe à l’ADN double brin.

Il présente l’avantage d’être utilisable sans restriction avec tous les systèmes de détection, mais n’assure qu’une spécificité relative qui peut nécessiter une vérification ;

– Sonde spécifique : ce système utilise soit une sonde doublement marquée à ses deux extrémités, soit deux sondes se fixant en tandem sur la séquence cible.

La particularité de cette dernière technologie (système Taqman) est d’ajouter aux deux amorces une sonde fluorescente qui possède deux fluorophores différents : un Reporter (FAM) en 5’ et un Quencher (TAMRA) en 3’.

Lorsque la sonde est intacte, la proximité du Reporter et du Quencher induit la suppression de la fluorescence du Reporter par le phénomène de tranfert d’énergie appelé FRET (fluorescent resonance energy transfert).

Lors de la PCR, la Taq polymérase commence l’élongation et dégrade la sonde par son activité 5’exonucléasique, et donc sépare le Reporter du Quencher qui ne pourra alors plus empêcher l’émission fluorescente du Reporter.

La fluorescence émise par le Reporter est ainsi proportionnelle à la quantité de sonde dégradée et donc de produit de PCR accumulé.

Les avantages de l’approche sonde spécifique sont, d’une part la grande spécificité apportée par la sonde, et d’autre part, pour certaines applications, la possibilité de coamplifier plusieurs séquences cibles dans la même réaction en utilisant des sondes marquées par des fluochromes différents.

Son coût est cependant nettement plus élevé.

La quantification de la séquence cible se fait grâce à l’établissement d’une courbe de calibration avec des dilutions d’une lignée positive ou des plasmides.

Pour chaque point de la gamme, on définit le seuil de détection également appelé « cycle threshold » (Ct) à partir duquel la fluorescence détectée dépasse le seuil de positivité (threshold), ce qui permet d’établir une courbe d’étalonnage.

Il suffit alors de reporter le Ct obtenu pour l’échantillon à analyser dans cette courbe et d’en déduire une quantification de la cible.

L’efficacité et la spécificité de la PCR sont évaluables par la pente de cette courbe (slope) qui doit être proche de 3,3, ce qui correspond à une efficacité de 100 %.

Le résultat est corrigé grâce à l’amplification sur le même échantillon d’un gène domestique d’expression ubiquitaire qui permet la normalisation quantitative et qualitative de l’échantillon analysé.

Le choix de ce gène est crucial, en effet il doit être d’expression constante quels que soient les tissus ou les pathologies en cause.

De plus, son niveau d’expression et sa cinétique de dégradation doivent être proches de ceux du gène cible analysé.

Différents modes de calcul sont proposés.

Leur description dépasse le cadre de cet article.

Il faut enfin signaler que cette technologie permet également la mise en évidence de mutations ponctuelles grâce à des « courbes de fusion », dont les applications, très larges en génétique, n’ont pas été encore définies en hématologie.

En conclusion, cette technologie apporte, au-delà de son aspect quantitatif, une définition de la qualité du matériel étudié, grâce à l’utilisation d’un gène domestique, très nettement supérieure aux approches qualitatives.

Sa facilité d’utilisation et les avantages qu’elle apporte en font certainement une approche dont les applications seront de plus en plus larges.

Applications à l’hématologie maligne :

A - ÉVALUATION INITIALE :

1- Détection d’une population clonale :

La mise en évidence d’une population clonale est un argument important de la nature maligne d’une prolifération hématopoïétique, bien que la corrélation ne soit pas parfaite.

Les techniques les plus répandues permettant de détecter une population cellulaire clonale sont soit l’examen cytogénétique montrant une anomalie caryotypique, soit l’étude du réarrangement des gènes d’immunoglobulines (Ig) ou du récepteur des cellules T (TCR pour T cell receptor) dans une prolifération lymphoïde, soit l’étude de l’inactivation d’un seul chromosome X chez une femme pour l’étude d’une prolifération myéloïde.

* Clonalité lymphoïde :

Bien que la détection d’une population lymphoïde B mature clonale soit possible depuis longtemps par une analyse de l’expression des chaînes légères d’Ig (j ou k) par immunophénotypage ou par détection d’une paraprotéine monoclonale, une analyse équivalente des populations lymphoïdes pré-B ou T n’était pas possible.

L’identification et la caractérisation des gènes codant des molécules de surface (Ig pour les lymphocytes B, TCR pour les lymphocytes T) ont permis la mise en évidence de clones lymphoïdes par détection des réarrangements soit des gènes d’Ig, soit ceux du TCR, initialement par hybridation par la méthode de Southern puis par PCR.

+ Réarrangements des gènes d’Ig et du TCR :

Les Ig sont composées de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères, tandis que le complexe du TCR comporte soit une chaîne a et une chaîne b, soit une chaîne c et une chaîne d.

La structure et les mécanismes de réarrangement des gènes codant les chaînes lourdes (IgH, chromosome 14q32), les chaînes légères (Ig j, chromosome 2p12 et Ig k, chromosome 22q11), le locus des TCR a/d (chromosome 14q11), le TCR b (chromosome 7q35) et le TCR c (chromosome 7p15) sont similaires.

Dans leur configuration non réarrangée (appelée germinale), elles consistent en de nombreux segments discontinus dénommés : variable (V), de jonction (J) et, pour les gènes des IgH, du TCR b et du TCR d uniquement, de diversité (D).

Il existe aussi en aval de ces segments, un ou deux segments constants (C).

Au cours de la différenciation lymphoïde, la diversité des gènes d’Ig et du TCR est générée par un processus de recombinaison entre ces segments V, (D) et J.

Dans le système IgH, par exemple, un des deux allèles IgH subit d’abord une recombinaison génique entre un des segments DH et un des segments JH, entraînant l’excision de l’ADN les séparant.

Dans un deuxième temps, un des segments VH se recombine au réarrangement DHJH, créant ainsi une unité de transcription VHDHJH.

Ce gène réarrangé est d’abord transcrit en pré-messager puis, après épissage des introns séparant le segment JH du segment CH, l’ARN messager (ARNm) VHDHJHCH est traduit en protéine IgH mature.

L’ordre de réarrangement des gènes d’Ig est IgH puis Ig j et enfin Ig k tandis que celui des gènes des TCR est : TCR d puis TCR c et TCR b et finalement TCR a avec délétion du TCR d sur le même allèle puique le locus du TCR d est à l’intérieur du locus TCR a, entre les segments Va et Ja.

La production d’une Ig ou d’un TCR fonctionnel nécessite la juxtaposition, dans une même unité de transcription et dans le même cadre de lecture, des segments V, D et J.

Si le réarrangement V-(D)-J du premier allèle s’avère fonctionnel, le processus dit d’exclusion allélique empêche le réarrangement du deuxième allèle.

Sinon un deuxième réarrangement a lieu sur l’autre allèle, augmentant ainsi la possibilité de produire un récepteur fonctionnel.

Le réarrangement de segments V, D et J est réalisé par l’intermédiaire de signaux de recombinaison (RSS pour recognition signal sequences) situés en aval des segments V, en amont des segments J et de part et d’autre des segments D.

Ces RSS, qui sont similaires dans tous les gènes d’Ig et du TCR, comportent un heptamère (c’est-à-dire une séquence de sept nucléotides) hautement conservé et un nonamère (une séquence de neuf nucléotides) riche en bases A et T, séparés par une séquence non conservée soit de 12, soit de 23 paires de bases.

Ces RSS servent à diriger le système de recombinaison, encore mal compris mais partiellement médié par deux gènes, RAG-1 et 2 (recombinase activating gene), vers les segments V, D et J.

Trois mécanismes concourent à la génération de la diversité des gènes des Ig et du TCR :

– réarrangement combinatoire.

La diversité des gènes des Ig et du TCR, qui peut être générée par la recombinaison V(D)J, est déterminée par le nombre de segments V, D et J de chaque locus. Cette diversité combinatoire varie beaucoup selon les gènes ;

– diversité jonctionnelle.

Lors du réarrangement, les séquences situées à la jonction des segments V, D ou J, peuvent être modifiées soit par la délétion des nucléotides situés en aval des segments V, en amont des segments J, et de part et d’autre des segments D, soit par l’addition de courtes séquences non codées à l’état germinal, et ajoutées grâce à l’activité de la terminal-désoxynucléotidyltransférase (TdT), créant ainsi les régions « N » ou CDR3 (complementarity determining region) de séquences et de longueurs hautement variables.

Dans la majorité des cas (deux tiers en théorie), ces processus de recombinaison créent une séquence dont le cadre de lecture n’est pas conservé : elle peut être transcrite en ARN mais ne peut être traduite en protéine (réarrangement non fonctionnel).

Lors de la différenciation lymphoïde, seuls les lymphocytes capables d’exprimer un récepteur à l’antigène fonctionnel sont sélectionnés.

Il en découle que les réarrangements retrouvés dans une cellule ou dans un clone lymphoïde immature peuvent être non fonctionnels, mais qu’au moins un des deux réarrangements des populations lymphoïdes matures est fonctionnel ;

– mutation somatique.

La séquence des gènes d’Ig réarrangés (mais pas celle des gènes du TCR) peut être modifiée par mutation ponctuelle des nucléotides avoisinant les régions codant les séquences protéiques qui reconnaissent l’antigène.

Ce mécanisme sert à augmenter l’affinité de la molécule d’Ig vis-à-vis de son antigène (maturation d’affinité).

+ Détection d’un réarrangement d’Ig ou du TCR :

– Hybridation par la méthode de Southern.

Le processus de réarrangement des gènes d’Ig ou du TCR entraîne une modification des positions relatives des sites de restriction, et donc de la taille des fragments d’ADN reconnus par une sonde IgH, par exemple.

Dans une prolifération lymphoïde polyclonale, chaque réarrangement produit un fragment d’ADN de taille différente selon les segments V et D utilisés ; en raison de cette hétérogénéité, chaque réarrangement reste en dessous du seuil de détection par la méthode de Southern (sensibilité d’environ 5 à 10%).

Dans une population clonale, en revanche, tous les réarrangements sur un allèle sont de taille identique et produisent une bande réarrangée.

Comme le locus IgH se réarrange en premier, la détection d’une population lymphoïde B clonale se fait surtout par analyse de ce locus.

Dans les proliférations plus matures, le réarrangement des chaînes légères peut être utile pour confirmer leur caractère clonal.

Cependant, le locus Ig j est parfois délété, et l’analyse du locus Ig k par Southern est rendue plus complexe par la présence de plusieurs gènes Ck.

Les réarrangements des TCR b, c et d ont lieu à la fois dans les précurseurs T ab et cd, et leur mise en évidence ne permet donc pas de distinguer entre les proliférations des deux lignées.

Un réarrangement du TCR a indique une différenciation vers la lignée TCR ab mais comme le nombre important de segments Ja rend difficile l’analyse directe de ce locus par la technique de Southern, c’est souvent la présence d’une délétion biallélique du TCR d qui fournit une évidence indirecte du réarrangement du TCR a.

La détection d’une population T clonale par la méthode de Southern se fait le plus souvent avec une sonde du TCR b, ce locus étant réarrangé à un stade relativement précoce de la différenciation T.

Un réarrangement majoritaire des TCR c ou d indique la présence d’une population clonale, et peut être utile dans les proliférations très précoces.

En revanche, le nombre limité de combinaisons de segments V, D et J des TCR c et d, et l’utilisation préférentielle de certains segments dans certains tissus signifient que la présence d’une bande minoritaire réarrangée peut représenter soit une sous-population clonale, soit des lymphocytes T réactionnels qui utilisent tous les mêmes segments V et J, limitant ainsi l’intérêt de ces loci pour la détection des clones minoritaires.

– PCR.

La technique de Southern, malgré l’amélioration qu’elle a apportée dans notre compréhension des proliférations lymphoïdes, présente certains désavantages.

La détection des réarrangements clonaux des Ig ou du TCR par PCR représente une stratégie alternative plus rapide, non radioactive et au moins aussi sensible, qui en outre peut être effectuée avec beaucoup moins d’ADN.

L’amplification à partir de l’ADN avec des amorces spécifiques des segments V et J, permet l’amplification de la région hypervariable V(D)J, dite région N ou CDR3.

Dans une population lymphoïde clonale, la jonction V-(D)-J est identique dans toutes les cellules, tandis que dans une prolifération polyclonale, la taille des jonctions est variable.

L’analyse des produits d’amplification après électrophorèse sur gel d’acrylamide, de meilleur résolution que celle sur gel d’agarose, permet la distinction entre population clonale (bande discrète) et polyclonale (traînée d’ADN).

L’utilisation de ces techniques pour la détection de la clonalité a été appliquée à l’analyse des réarrangements des gènes du TCR c et des IgH.

Le répertoire restreint du locus du TCR c permet l’utilisation d’un mélange d’oligonucléotides spécifiques de chaque segment V et J, tandis que la complexité du locus des IgH nécessite l’utilisation d’oligonucléotides « consensus » qui reconnaissent des séquences conservées entre les différents segments V et J, soit de toutes les familles VH

L’inconvénient majeur de l’utilisation du TCR c pour l’analyse par PCR est la présence dans le sang de jonctions V-J « canoniques » ayant peu de diversité jonctionnelle pouvant donner des résultats faussement positifs par PCR avec certains segments (Vc9 et JP par exemple) si leur présence n’est pas suspectée.

La qualité de l’analyse du produit de PCR peut être améliorée grâce à l’utilisation d’amorces fluorescentes.

Par cette approche, on peut définir de manière précise la taille du réarrangement amplifié, ce qui peut être d’une aide précieuse lors de l’analyse de prélèvements de suivi, ou pour définir un envahissement a minima (bilan d’extension) de prélèvements périphériques.

Par ailleurs, l’utilisation d’amorces marquées par des fluochromes différents, permet dans une PCR multiplex, d’identifier les différents segments V ou J impliqués dans le réarrangement.

Ceci apporte une meilleure compréhension des répertoires utilisés dans différentes pathologies, et peut également s’avérer utile pour l’analyse de prélèvements de suivi.

On peut par ailleurs identifier les réarrangements dits canoniques, et éliminer ainsi le risque de faux positifs lié à leur présence au sein d’un répertoire très restreint.

Cette approche présente par ailleurs l’avantage d’être très reproductible et facile à mettre en oeuvre.

Il faut cependant signaler le risque de détection de faux positifs par la PCR fluorescente, notamment lorsque le répertoire étudié est restreint ou peu utilisé, comme par exemple dans l’analyse des réarrangements du TCR gamma ou delta.

En conclusion, si cette méthologie présente d’indiscutables avantages, son utilisation suppose une bonne expérience et une interprétation ici plus qu’ailleurs, en fonction de la pathologie sous-jacente.

+ Apport de l’analyse des réarrangements des gènes des Ig et du TCR :

La mise en évidence d’un réarrangement clonal des gènes des Ig et du TCR représente un argument décisif de la nature clonale d’une prolifération lymphoïde.

Ceci est particulièrement important lorsque l’aspect morphologique ou histologique est polymorphe, ce qui est parfois le cas dans certains lymphomes.

Il faut cependant signaler que, bien que dans la plupart des cas la présence d’une population clonale signifie une population maligne, ceci n’est pas toujours vrai.

D’une part, il existe certaines proliférations lymphoïdes clonales dont l’évolution clinique ne correspond pas à celle d’un processus malin, telles les populations lymphoïdes B associées à une gammapathie monoclonale bénigne, la papulose lymphomatoïde et certaines proliférations à grands lymphocytes à grains (LGL pour large granular lymphocytes).

D’autre part, le développement de techniques de plus en plus sensibles permet de mettre en évidence la présence de populations réactionnelles, qui représentent en fait l’expansion d’une population clonale lymphoïde stimulée par l’antigène.

Ces populations réactionnelles clonales sont détectées surtout si le répertoire de réarrangements des TCR est restreint, comme dans les lymphocytes T cd du sang et les lymphocytes T ab de l’intestin.

Malgré ces limitations, la mise en évidence d’une population lymphoïde clonale a beaucoup aidé notre capacité à distinguer les proliférations bénignes des proliférations malignes.

L’analyse des réarrangements des Ig et du TCR permet aussi de déterminer la nature lymphoïde de certaines proliférations.

Historiquement, avant le développement des anticorps monoclonaux spécifiques des sous-populations lymphoïdes, c’est la mise en évidence des réarrangements des gènes d’IgH qui a permis la démonstration de l’appartenance à la lignée B de la plupart des LAL de l’enfant.

De la même manière, la détection des réarrangements des gènes des Ig a fourni la preuve que les leucémies à tricholeucocytes étaient des tumeurs lymphoïdes B.

La démonstration d’une population T clonale, même minoritaire, dans certaines proliférations polymorphes, telles que la lymphadénopathie angio-immunoblastique, a permis de les classer dans le cadre des lymphomes T périphériques.

L’analyse des réarrangements des gènes d’Ig et du TCR dans une population lymphoïde, dont la nature T ou B n’est pas clairement établie par l’immunophénotypage, permet parfois de déterminer la lignée lymphoïde impliquée (T ou B), surtout dans les proliférations matures.

Il existe cependant une incidence non négligeable de réarrangements dits « illégitimes » dans les proliférations lymphoïdes immatures, surtout dans les LAL.

Le TCR c, par exemple, est réarrangé dans 40 à 70 % des LAL de la lignée B.

L’explication de ces réarrangements illégitimes dans les LAL est probablement liée au fait que les lymphocytes T et B utilisent le même système de recombinaison des gènes des Ig ou du TCR.

Il en découle que l’utilisation des réarrangements des gènes du TCR ou des Ig pour faire la distinction entre prolifération T ou B est plus fiable pour l’analyse des populations matures dans la mesure où ces réarrangements « illégitimes » sont beaucoup plus rares, mais, dans tous les cas, ces résultats doivent être interprétés en fonction des données cliniques, morphologiques et immunologiques.

* Clonalité associée à l’inactivation aléatoire du chromosome X :

Quand l’étude du réarrangement des gènes d’Ig et du TCR n’est pas possible, la détermination de la présence d’une population clonale est plus délicate.

L’analyse de la clonalité associée à l’inactivation aléatoire du chromosome X est basée sur deux principes :

– l’existence de polymorphismes sur les deux chromosomes X, permettant la distinction des deux allèles ;

– l’inactivation aléatoire d’un des deux chromosomes X chez la femme au cours de l’embryogenèse (habituellement au stade huit à 16 cellules).

L’inactivation du chromosome X peut être étudiée de deux manières :

– au niveau de l’expression (soit des protéines [glucose 6-phosphate déshydrogénase], soit des ARN messagers, le chromosome inactif n’étant pas transcrit) ;

– par étude de la méthylation, en utilisant des enzymes sensibles à la méthylation comme HpaII ou HhaI, qui ne coupent pas quand le site de restriction est méthylé.

En effet, le chromosome inactif est hyperméthylé.

En pratique, trois gènes sont étudiés pour l’analyse de la clonalité : le gène de la phosphoglycérate kinase (PGK), celui de l’hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPRT), et celui du récepteur des androgènes (AR).

Combinées, ces trois méthodes permettent d’analyser la clonalité chez la quasi-totalité des femmes, mais elles sont limitées aux femmes ayant des proliférations majoritaires (> 25 % de la population cellulaire analysée) et leurs analyses sont d’interprétation délicate.

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