Rechercher dans le site  |   Devenir membre
      Accueil       |      Forum     |    Livre D'or      |     Newsletter      |      Contactez-nous    |                                                                                                          Envoyer par mail  |   Imprimer

 
Hématologie
Application à l’hématologie maligne des techniques de biologie moléculaire (Suite)
Cours d'hématologie
 


 

2- Détection moléculaire des anomalies chromosomiques.

L’évaluation du pronostic des leucémies et notre compréhension des mécanismes d’oncogenèse se sont améliorées grâce à l’identification d’anomalies caryotypiques associées à certains types de tumeurs et à l’analyse moléculaire des gènes impliqués, expliquant ainsi l’importance croissante de la cytogénétique en hématologie.

Il existe cependant certaines situations où la cytogénétique classique ne permet pas de mettre en évidence ces anomalies.

Ainsi, il est parfois difficile d’obtenir des métaphases de qualité acceptable, comme par exemple lorsqu’un prélèvement est effectué après chimiothérapie, ou dans les proliférations matures où l’index mitotique est moins important, ou encore quand la population maligne est minoritaire.

De plus, l’analyse des métaphases n’est pas possible sur du matériel congelé ou fixé en paraffine.

Certaines anomalies chromosomiques sont difficiles à détecter par une analyse classique, comme l’inversion du chromosome 16 des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) M4 avec éosinophiles anormaux.

Il existe aussi un nombre croissant d’anomalies détectées par biologie moléculaire qui ne sont pas visibles par caryotype classique.

La résolution maximale possible par analyse des chromosomes marqués en bandes R ou G est de l’ordre de 1 à 10 mégabases d’ADN (c’est-à-dire 1 à 10 millions de paires de bases).

La délétion tald, par exemple, anomalie chromosomique la plus fréquente dans les LAL-T (environ 25 % des cas), consistant en une délétion spécifique de 90 kilobases d’ADN en amont du gène tal-1, n’est pas visible par caryotype classique, mais peut être détectée facilement soit par la méthode de Southern, soit par PCR.

La fréquence élevée de la délétion de CDK4I, gène important dans la régulation du cycle cellulaire, observée dans plusieurs tumeurs, y compris les leucémies, suggère que les microdélétions peuvent représenter un mécanisme important d’oncogenèse.

En revanche, les techniques moléculaires de détection ne permettent pas l’analyse globale du caryotype et la détection d’anomalies nouvelles ou inattendues.

Pour toutes ces raisons, l’analyse des hémopathies malignes nécessite de plus en plus une approche complémentaire à la fois par la cytogénétique classique et par la cytogénétique moléculaire.

* Détection des anomalies chromosomiques par PCR :

La détection des anomalies chromosomiques (translocation ou inversion) par PCR est fondée sur la juxtaposition anormale de deux séquences nucléotidiques bien définies.

Il est donc évident que seules les anomalies bien caractérisées sur le plan moléculaire, associées à des points de cassure conservés, soit au niveau de l’ADN, soit de l’ARN, peuvent être détectées par cette technique. Seules les caractéristiques générales des anomalies fréquentes (> 5 %) ou associées à un sous-type particulier, donc d’importance diagnostique et/ou pronostique, sont incluses dans cet article.

Il existe deux catégories majeures d’anomalies chromosomiques.

+ Anomalies qualitatives :

Il s’agit de translocations conduisant à l’expression d’un transcrit de fusion résultant en la juxtaposition des parties codantes de deux gènes. Elles sont détectés par RT-PCR à partir de l’ARN.

Ces anomalies se retrouvent dans les tumeurs lymphoïdes et myéloïdes.

Les transcrits de fusion et donc les produits de PCR sont identiques chez tous les malades atteints du même type de translocation et impliquant les mêmes introns.

Cette uniformité rend possible la détection de la quasi-totalité des translocations avec une ou deux paires d’amorces d’amplification mais, du fait de cette uniformité, cette analyse est très sensible aux contaminations de la PCR.

À titre d’exemple, les translocations t(9 ; 22)(q34 ; q11) des LMC et des LAL sont identiques sur le plan caryotypique mais diffèrent sur le plan moléculaire, bien que toutes les deux impliquent les gènes bcr et abl.

Dans les deux cas, le point de cassure du chromosome 9 se produit au sein de l’intron 1 du gène abl, qui s’étend sur environ 200 kb.

En revanche, les points de cassure sont plus éparpillés sur le chromosome 22.

Dans la grande majorité des LMC, la translocation se trouve dans la partie centrale du gène bcr (major breakpoint cluster region ou M-BCR), soit entre les exons 13 et b3, soit entre les exons 14 et 15.

Cette hétérogénéité génomique produit deux types de transcrits de fusion, qui peuvent être distingués selon la taille des fragments générés par RT-PCR avec une paire d’amorces spécifiques des exons 13 de bcr et 2 de abl.

Ces transcrits de fusion sont traduits en protéine anormale dite p210. Dans les LAL possédant une translocation t(9 ; 22), la majorité des cas est caractérisée par un point de cassure bien plus en amont du gène bcr, dans l’intron 1 (minor breakpoint cluster region ou m-BCR), et sont détectés par RT-PCR avec des amorces spécifiques de l’exon 1 de bcr et de l’exon 2 de abl.

Le produit protéique de ce gène s’appelle p190.

+ Anomalies quantitatives :

Il s’agit de translocations conduisant à l’expression aberrante d’un proto-oncogène qualitativement normal, suite à sa juxtaposition à une séquence régulatrice inhabituelle, souvent un gène des Ig ou du TCR.

Les points de cassure du côté du proto-oncogène se trouvent en dehors de la partie codante du gène, parfois à une distance considérable (une centaine de kb pour les t(11 ; 14)(q13 ; q32) des lymphomes du manteau par exemple) et la protéine reste donc intacte.

Le résultat final de ces anomalies est une dérégulation de l’expression du proto-oncogène, soit à un stade inhabituel de la différenciation ou du cycle cellulaire, soit au niveau d’un tissu n’exprimant pas ce produit physiologiquement.

Ces anomalies chromosomiques représentent souvent des erreurs de la recombinase lors des réarrangements des gènes codant les Ig ou le TCR et se retrouvent, par conséquent, dans les tumeurs lymphoïdes.

Les points de cassure sont situés au niveau d’un RSS réel du côté des Ig ou du TCR, le plus souvent du type heptamèrenonamère, et d’une séquence qui lui ressemble du côté du protooncogène.

L’accessibilité de cette séquence de type RSS à la recombinase est probablement déterminée par la configuration chromatinienne ouverte du gène due à son activité transcriptionnelle ; ceci suggère que ces proto-oncogènes sont actifs lors du réarrangement des gènes d’Ig ou du TCR.

La jonction nucléotidique entre les deux chromosomes est soumise aux mêmes modifications que les réarrangements physiologiques des Ig ou du TCR, créant ainsi une région N spécifique de chaque malade.

L’amplification de ce type de translocation par PCR se fait à partir de l’ADN (même à partir de matériel fixé) et génère des produits de PCR de taille variable, ce qui rend plus facile l’identification de la translocation de chaque malade et donc leur distinction d’éventuels produits contaminants.

En revanche, seuls les points de cassure qui sont regroupés dans la région avoisinant les amorces d’amplification sont détectés.

L’amplification par PCR de la région principale de cassure (MBR pour major breakpoint cluster) de la translocation t(14 ; 18) des lymphomes folliculaires, par exemple, ne détecte que les 70 % des cas caractérisés par une translocation t(14 ; 18) caryotypique dont le point de cassure est situé dans MBR, ou les 5 % des cas dont le point de cassure est situé dans mcr (minor cluster region).

De même, la détection par PCR de la translocation t(11 ; 14) des lymphomes du manteau est positive seulement dans la moitié des cas, quand le point de cassure implique la région préférentielle de translocation MTC (major translocated cluster) en amont du gène dérégulé, CCND-1 ou PRAD-1.

La plupart des translocations de ce type analysées en routine impliquent le gène IgH.

La délétion tald, en revanche, n’implique pas les gènes des Ig ou du TCR, mais est apparentée dans la mesure où elle est médiée par la recombinase, et où la juxtaposition de la partie 5’ non codante du gène SIL, en amont de la délétion, à la partie codante de tal-1, conduit à une expression aberrante de la protéine Tal-1.

* Limites de détection des translocations :

+ Points de cassure trop étendus :

Il existe une autre catégorie de translocations non aléatoires qui ne se prête pas facilement à une analyse par PCR ou par RT-PCR.

Les translocations affectant le gène c-myc sur le chromosome 8q24 se trouvent d’une manière préférentielle dans le lymphome de Burkitt ou son équivalent leucémique, les LAL-L3.

Elles impliquent soit le chromosome 14 (gènes IgH) soit, plus rarement, les chromosomes 2 ou 22 (gènes Ig j ou Ig k respectivement).

Même si le résultat final de toutes ces anomalies est la dérégulation de l’expression du gène c-myc, les points de cassure sont très hétérogènes, à la fois sur le chromosome 8, où elles s’étendent sur environ 350 kb en amont ou en aval du gène c-myc, et du côté IgH où elles peuvent impliquer les segments JH ou les séquences de switch des régions CH (séquences d’ADN intervenant dans le phénomène de commutation de classe des Ig).

Il est évident qu’une telle hétérogénéité rend difficile la détection de ces translocations par PCR ou même par Southern.

+ Partenaires variables :

Il existe aussi des anomalies où un gène situé sur un chromosome donné est constamment impliqué, alors que le partenaire chromosomique est variable.

Les translocations touchant le segment 11q23, par exemple, impliquent les chromosomes : 4, 9, 19, 1, 2, 5, 6, 10, 15, 17 et X, les trois premiers chromosomes étant les plus fréquemment touchés.

Les anomalies du 11q23 se trouvent dans environ 5 à 10% des LAL et des LAM en général, et d’une manière préférentielle dans les leucémies aiguës des enfants âgés de moins de 1 an (70 %) et dans certaines leucémies secondaires.

Du côté du chromosome 11, toutes ces translocations impliquent le même gène, MLL, et la grande majorité des points de cassure sont regroupés dans une région d’environ 10 kb, favorisant leur détection par hybridation selon la méthode de Southern avec une sonde MLL.

De nombreux partenaires de MLL ont été clonés et il est possible de détecter la translocation t(4 ; 11) par RT-PCR.

On peut donc envisager la possibilité de détecter la grande majorité de ces translocations par RT-PCR, mais du fait de la grande variabilité des partenaires, un bilan moléculaire par hybridation par la méthode de Southern représente probablement un meilleur choix.

Une autre stratégie prometteuse est de détecter ces translocations par FISH avec une sonde MLL sur métaphase ou sur noyau interphasique.

Les translocations impliquant le gène LAZ-3/bcl-6 sur le chromosome 3q27, retrouvées dans environ 25 % des lymphomes B de haut grade, sont similaires dans la mesure où seulement 50 % des translocations impliquent un gène des Ig, les autres partenaires étant hétérogènes.

Une comparaison de l’intérêt des différentes stratégies d’analyse moléculaire (Southern, FISH et PCR) permettrait de définir la meilleure méthode de détection de ce type d’anomalie.

* Apport de l’analyse moléculaire des anomalies chromosomiques :

À la différence des réarrangements des Ig ou du TCR qui représentent des marqueurs indirects de malignité dans les tumeurs lymphoïdes, les anomalies chromosomiques sont plus ou moins directement impliquées dans le processus malin.

Leur détection aide donc non seulement au diagnostic mais aussi à l’évaluation du pronostic.

L’intérêt de l’analyse de chaque anomalie dépend de sa fréquence, de son importance pronostique et de leur facilité et fiabilité de détection.

+ Intérêt diagnostique :

Certaines anomalies sont pathognomoniques d’une maladie et leur mise en évidence devient nécessaire pour établir le diagnostic, notamment dans tous les cas ayant une présentation clinique atypique.

Entre 5 et 10 % des LMC n’ont pas de chromosome de Philadelphie (Ph1) correspondant à la translocation t(9 ; 22).

La détection d’un réarrangement impliquant les gènes bcr et abl, d’abord par Southern et plus récemment par RT-PCR, a montré que la majorité de ces cas présentait la même anomalie moléculaire que les LMC Ph1+.

Il devient maintenant difficile de porter un diagnostic de LMC en l’absence soit de la translocation t(9 ; 22), soit d’un réarrangement bcr-abl, et il est fort possible que les LMC « atypiques » n’ayant pas de réarrangement bcr-abl représentent une entité différente.

De la même manière, le diagnostic de LAM M3 en l’absence d’une translocation t(15 ; 17)(q22 ; q11) et/ou d’un transcrit de fusion PML-RAR a nécessite la mise en évidence d’une forme moléculaire variante telle que la translocation t(11 ; 17)(q23 ; q21) ou de son transcrit de fusion, PLZF-RAR a.

Du côté lymphoïde, la mise en évidence soit par caryotype classique, soit par analyse moléculaire de la translocation t(14 ; 18)(q32 ; q21) [IgH ; bcl-2] ou de la t(11 ; 14)(q13 ; q32) [bcl-1/CCND-1 ; IgH] aide au diagnostic différentiel entre un lymphome folliculaire et un lymphome du manteau.

+ Intérêt pronostique :

Dans les LAL de la lignée B, les translocations t(9 ; 22)(q34 ; q11), et t(4 ; 11)(q21 ; q23) représentent des marqueurs de mauvais pronostic.

Dans un nombre croissant de protocoles cliniques, leur mise en évidence, notamment pour bcr-abl, indique un changement de traitement vers un protocole plus agressif, voire une greffe de moelle allogénique.

Un bilan moléculaire systématique des gènes impliqués (bcr-abl, E2A-PBX-1 et AF-4-MLL et tel-aml1 respectivement) montre que ces anomalies peuvent ne pas être détectées par caryotype classique.

Cependant, les techniques de cytogénétique moléculaire, notamment FISH, ont une sensibilité proche des techniques de biologie moléculaire (en situation diagnostique) et la cytogénétique classique offre la possibilité d’une analyse globale susceptible d’orienter vers de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans l’oncogenèse et susceptibles d’avoir un impact pronostique.

Ces différentes techniques sont donc certainement complémentaires.

Au total, s’il est maintenant admis que la mise en évidence d’un réarrangement moléculaire de bcr-abl ou de MLL-AF4 est associée avec un pronostic défavorable dans les LAL-B, l’impact pronostique d’autres réarrangements comme TEL-AML1 ou E2A-PBX reste encore débattu et des études moléculaires systématiques dans le cadre de protocoles thérapeutiques homogènes devraient prochainement y répondre.

En ce qui concerne les LAM, les anomalies détectables par RT-PCR, telles que les transcrits de fusion PML-RAR a des LAM M3, AML- 1-ETO des LAM M2 et CBF b-MYH-11 des LAM M4 éosinophiles sont plutôt associées à un pronostic relativement favorable.

Il est envisageable que ces anomalies, à l’instar des anomalies des LAL, soient prises en compte lors de la stratification thérapeutique initiale de malades atteints de LAM.

Plus récemment, la détection d’une anomalie qualitative du gène FLT3, dont le couple ligand-récepteur joue un rôle central dans les étapes précoces de l’hématopoïèse, s’est révélée associée à un mauvais pronostic dans les LAM.

Cette anomalie consiste en une duplication en tandem d’une partie du gène FLT3.

Il s’agit d’un facteur pronostique défavorable et indépendant présent dans environ 20 % des LAM.

Il est probable que les futurs protocoles de chimiothérapie des LAM proposeront une stratification thérapeutique différente en fonction de la présence ou non de cette anomalie, dont la mise en évidence est essentiellement accessible par les méthodes moléculaires (PCR).

B - SUIVI DES MALADES APRÈS TRAITEMENT :

L’identification de marqueurs moléculaires clonospécifiques permet la surveillance du clone tumoral après traitement et donc la détection de la maladie résiduelle, voire l’émergence de sous-clones résistants.

Cette évaluation a désormais une place importante et croissante dans la prise en charge des hémopathies malignes.

1- Détection de la maladie résiduelle :

La maladie résiduelle est définie par la persistance des cellules tumorales qui ont survécu à la chimiothérapie, présentes en nombre inférieur au seuil de détection des méthodes morphologiques classiques (moins de 5 % de blastes).

Il a été estimé que la masse tumorale totale au moment du diagnostic d’une leucémie est de l’ordre de 1012 cellules, et que l’induction la réduit d’au moins deux logs décimaux.

Il en résulte que la « rémission complète » peut représenter entre 0 et 1010 cellules tumorales.

La sensibilité de la détection des cellules tumorales rares par PCR dépasse de plusieurs logs décimaux celle d’autres techniques.

* Détection moléculaire des anomalies chromosomiques :

+ Leucémie myéloïde chronique :

L’anomalie chromosomique la plus recherchée par PCR pour le suivi des malades est bcr-abl dans les LMC.

Cette recherche doit désormais se faire par PCR quantitative, et il est probable qu’une cinétique croissante de l’évolution du taux de transcrit peut avoir une incidence thérapeutique directe pour les patients, qu’il s’agisse d’adapter la posologie des traitements médicamenteux (comme l’imatinib ou l’interféron) ou de moduler l’immunosuppression et/ou de réinjecter des lymphocytes du donneur pour induire un effet greffon contre leucémie (GVL) chez les patients ayant bénéficié d’une allogreffe de moelle.

L’utilisation de la PCR quantitative est par ailleurs un atout indispensable dans l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques comme les inhibiteurs de la tyrosine kinase dans cette pathologie.

+ Leucémies aiguës :

De nombreuses données récentes de la littérature ont apporté la preuve de la pertinence du monitorage de la maladie résiduelle minime (MRM) dans les LAL pour l’identification de groupe à haut risque de rechute dont le pronostic pourrait être amélioré par un traitement intensif.

Les protocoles thérapeutiques des LAL notamment, sont désormais stratifiés en fonction du niveau de détection de la MRM, après les premières cures de chimiothérapie.

Cette évaluation initialement réalisée par des méthodes semiquantitatives ou compétitives sera, à terme, réalisée en PCR quantitative.

Les cibles utilisables sont de deux types : soit des remaniements chromosomiques (30 % environ des LAM et des LAL), soit des réarrangements VDJ clonospécifiques (90 % des LAL).

Les premiers présentent l’avantage d’être stables au cours de l’évolution de la maladie, mais ne concernent qu’un tiers des patients.

Les réarrangements VDJ permettent une informativité de plus de 90 % dans les LAL, mais ont l’inconvénient d’être instables, notamment par évolution clonale ou émergence d’un sous-clone avec un réarrangement différent.

* Détection des réarrangements des Ig et du TCR :

Pour près de 90 % des malades atteints de LAL, les réarrangements des gènes des Ig et/ou du TCR peuvent représenter des marqueurs moléculaires permettant l’analyse de la maladie résiduelle.

Ces stratégies sont de deux types : distinguer la population clonale résiduelle de la population réactionnelle par la taille des fragments générés par PCR ; détecter d’une manière spécifique la région N du réarrangement V-(D)-J du clone de départ.

Cette deuxième stratégie nécessite soit le séquençage de la région N et la fabrication d’un oligonucléotide spécifique, soit l’utilisation du produit d’amplification de la région N comme sonde spécifique.

Plus récemment ont été mises au point des techniques semi-quantitatives par compétition utilisant un standard interne, ou quantitatives par PCR quantitative dont la place dans la stratification thérapeutique des leucémies aiguës reste à préciser.

Il faut juste signaler que la stratégie spécifique de la région CDR3, soit par hybridation, soit par PCR quantitative, est plus spécifique et plus sensible (de l’ordre de 10-4 à 10-5 soit une cellule maligne pour 10 000 à 100 000 cellules normales par rapport à 10-3) mais a l’inconvénient de détecter seulement le clone de départ.

2- Évolution clonale :

La comparaison par la méthode de Southern et/ou par PCR des réarrangements des gènes d’Ig ou du TCR dans les tumeurs lymphoïdes lors du diagnostic et de la rechute, peut permettre de déterminer si la rechute représente la réapparition du même clone ou son remplacement par un autre clone.

L’apparition d’un nouveau réarrangement des gènes d’Ig ou du TCR peut représenter soit une modification du réarrangement majoritaire, soit l’émergence d’un sous-clone minoritaire pouvant être sélectionné par une résistance à la chimiothérapie.

La mise en évidence de certaines anomalies moléculaires, telles que les mutations ponctuelles de l’anti-oncogène p53 lors d’une rechute, permet de caractériser l’apparition de clones plus agressifs.

Ces anomalies moléculaires sont souvent corrélées avec une aggravation clinique ou l’acquisition de nouvelles anomalies caryotypiques.

3- Détection de la résistance aux drogues :

L’analyse des mécanismes de résistance à la chimiothérapie reste pour l’instant confinée aux laboratoires de recherche.

Certains gènes responsables de l’efflux des agents cytotoxiques des cellules hématopoïétiques, comme mdr-1 (pour multidrug resistance), ont été identifiés.

L’expression de mdr-1 peut être détectée par des techniques d’immunohistochimie au niveau protéique ; par hybridation in situ ; par dot-blot ou par RT-PCR au niveau de l’ARN messager ; et par mesure de la vitesse d’efflux d’un fluorochrome au niveau de l’analyse fonctionnelle.

Une hyperexpression est observée fréquemment lors de la rechute des LAM, des myélomes et des lymphomes.

Au diagnostic des LAM, l’hyperexpression de mdr-1 représente un facteur de mauvais pronostic qui prédit une résistance à la chimiothérapie.

Il reste donc à déterminer quelle technique sera la plus fiable pour l’analyse en routine des malades.

4- Évaluation moléculaire postallogreffe :

Il est parfois important de déterminer si la reconstitution hématopoïétique après allogreffe est celle du receveur ou du donneur.

S’il existe une différence de sexe entre le receveur et le donneur, cette analyse peut se faire par détection du chromosome Y, soit par marquage à la quinacrine sur métaphase, soit par FISH sur noyau interphasique avec une sonde Y.

Quand il n’y a pas de différence de sexe, la distinction entre l’hématopoïèse de type receveur ou de type donneur se faisait historiquement à l’aide des minisatellites (VNTR), mais de plus en plus elle se fait par étude des microsatellites (STR).

Perspectives d’avenir :

L’analyse moléculaire des gènes impliqués dans l’oncogenèse hématopoïétique a permis d’identifier des anomalies à différents niveaux de la fonction cellulaire :

– anomalies de l’expression des récepteurs de surface ;

– anomalies de la transmission des signaux d’activation ;

– anomalies de localisation intranucléaire des protéines ;

– anomalies impliquant les facteurs de transcription ;

– dérégulation du cycle cellulaire ;

– inhibition de l’apoptose.

L’identification de ces anomalies, plus ou moins spécifiques des tumeurs, permettra le développement de stratégies thérapeutiques adaptées.

Ainsi la démonstration dans les LAM M3, caractérisées par une translocation impliquant le récepteur a de l’acide rétinoïque (RAR a), qu’il est possible de traiter les malades par de l’acide rétinoïque tout-trans, et d’induire ainsi une différenciation des blastes promyélocytaires vers des formes granulocytaires plus matures, illustre une application thérapeutique des observations plus fondamentales.

Des développements dans le domaine de la thérapie génique ont déjà permis le remplacement d’un gène déficitaire dans un syndrome d’immunodéficience congénitale (déficit en adénosine désaminase), et il est à espérer que cette stratégie puisse éventuellement être appliquée au remplacement des antioncogènes déficitaires dans les tumeurs hématopoïétiques.

De la même manière, l’utilisation de constructions antisens, soit par l’injection d’oligonucléotides, soit par l’expression de vecteurs antisens, permettra peut-être une inhibition de l’expression ou des effets des oncogènes.

Que pensez-vous de cet article ?

  Envoyer par mail Envoyer cette page à un ami  Imprimer Imprimer cette page

Nombre d'affichage de la page 2702

Copyright 2014 © Medix.free.fr - Encyclopédie médicale Medix