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Hématologie
Antigènes de surface en hématologie
Cours d'hématologie
 


 

Introduction :

Les cellules hématopoïétiques sont très bien caractérisées pour les marqueurs qu’elles portent à leur membrane : ces antigènes de surface permettent de définir l’appartenance d’une cellule à une lignée hématopoïétique (lignée érythrocytaire, monocytaire, lymphocytaire...) et également son stade de différenciation et d’activation.

Une nomenclature permettant de classer ces nombreux antigènes a été adoptée : elle consiste à regrouper, dans une même CD, tous les anticorps monoclonaux reconnaissant une même molécule ; par extension, la molécule elle-même est appelée CDn.

À ce jour, plus de 150 CD sont définies.

Nous ne prétendons pas, dans cette revue, étudier l’intérêt de chaque antigène de surface dans tous les domaines de l’hématologie, mais nous souhaitons présenter une vision globale de l’intérêt que présente la connaissance des antigènes de surface.

Nous n’étudierons pas les récepteurs spécifiques aux antigènes, qu’il s’agisse du récepteur de la celluleTou des immunoglobulines de surface pour la cellule B, nous avons également exclu les récepteurs des cellules NK (natural killer).

Nous verrons comment les antigènes de surface peuvent aider au diagnostic de différentes pathologies hématologiques en nous intéressant de façon plus approfondie aux pathologies malignes.

Nous aborderons la valeur pronostique de l’expression de certains antigènes ainsi que leur utilisation dans le cadre de la détection de la maladie résiduelle après traitement.

Nous nous intéresserons également à l’intérêt croissant pour les antigènes de surface dans un but de caractérisation et d’obtention de cellules souches hématopoïétiques.

Celles-ci peuvent être utilisées dans le cadre de greffes (auto- ou allogéniques) devant aboutir à la reconstitution de toutes les populations hématopoïétiques chez des patients traités par chimiothérapie, mais également dans le cadre de la thérapie génique.

Utilisation des antigènes de surface pour le diagnostic des pathologies hématologiques :

A - Cas des pathologies malignes :

1- Utilisation dans le diagnostic :

La détermination du phénotype des cellules fait maintenant partie à part entière des étapes dans l’établissement d’un diagnostic.

Celui-ci résulte donc de la convergence de différentes approches qui font aussi bien appel à des analyses morphologiques ou cytogénétiques qu’à la biologie moléculaire ou à l’étude du phénotype.

L’expression des antigènes de surface est le plus fréquemment déterminée par la technique de cytométrie en flux, dont nous ne reprenons pas les principes.

Les antigènes de surface permettent d’emblée d’établir l’appartenance d’une cellule à une lignée hématopoïétique. Ainsi, dans le cas des leucémies aiguës myéloïdes (LAM), les cellules expriment au moins un marqueur myéloïde : CD13, CD33 ou CD11b.

Les différents stades sont définis par des critères morphologiques et présentent des antigènes de surface associés à divers stades de différenciation : on observe ainsi des variations dans le taux d’expression des marqueurs myéloïdes CD13, CD14, CD33 ou CD34 ainsi qu’une diminution de l’intensité de l’expression du marqueur d’immaturité CD117.

Le stade de leucémie aiguë mégacaryoblastique (M7) est diagnostiqué en grande partie grâce à l’expression de CD61 et/ou de CD41 car aucune des techniques de routine n’est discriminante.

Dans le cas des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL), les antigènes de surface permettent de déterminer si les cellules sont de la lignée lymphocytaire T ou B et au sein de la lignée B, de déterminer le stade de différenciation.

Une difficulté est due au fait que peu d’antigènes de surface sont restreints à une lignée ; toutefois, les antigènes CD3 et CD22 ou CD79 alpha et bêta sont clairement discriminants entre les lignées T et B.

On parvient, en utilisant un panel d’anticorps monoclonaux (AcM), à définir les LAL T pour leur expression des antigènes CD3, CD7, CD5 et/ou CD2 et les LAL B qui portent CD19 et CD22.

La distinction entre les différents stades de différenciation B repose essentiellement sur la présence d’une immunoglobuline (Ig) de surface au stade B, d’une Ig cytosolique au stade pré-B et sur l’absence d’Ig au stade pro-B.

Ainsi, 60 % des LAL sont de phénotype pro-B et les lymphoblastes expriment alors les antigènes de surface HLA-DR et CD19 dans quasiment tous les cas.

C’est un antigène non spécifique de lignage CD10 qui a été l’un des premiers utilisés pour la sous-classification des LAL.

Son expression était considérée comme un marqueur des LALcommunes : il fut identifié en 1975 comme un antigène de surface de 100 kDa associé aux tumeurs et d’abord baptisé CALLA (common acute lymphoblastic leukemia antigen).

Plus récemment, il est apparu que CD10 était exprimé sur les précurseurs lymphoïdes T et B, sur les blastes B et sur les granulocytes ainsi que sur des cellules non hématopoïétiques.

Il s’agit de l’endopeptidase neutre associée à la membrane qui clive des peptides du côté aminoterminal de résidus hydrophobes : son rôle dans la différenciation et la prolifération cellulaires n’est pas clair.

En utilisant les antigènes de surface, il apparaît qu’il existe un certain nombre de leucémies aiguës dites biphénotypiques, c’est-à-dire dont les blastes coexpriment des antigènes associés à plus d’un lignage.

Ainsi, on trouve des cas de LALde l’enfant qui coexpriment des marqueurs myéloïdes (CD13, CD33) et des cas de LAM de l’enfant qui coexpriment des marqueurs lymphoïdes (CD2, CD19, CD20). Dans certaines LAL, les blastes coexpriment des marqueurs T et B (CD2+/CD19+ ou CD7+/CD19+).

Des corrélations sont apparues entre la translocation t(8 ; 21) et la coexpression de CD19 avec CD15 ou CD34, entre t(9 ; 22) et la coexpression de CD19 avec CD34 et enfin entre t(15 ; 17) et la coexpression de CD2 avec des antigènes de surface myéloïdes.

Ces translocations n’impliquent pas les régions chromosomiques codant les antigènes impliqués : la relation entre ces translocations et l’expression de certains marqueurs n’est donc pas établie.

Dans le cadre des leucémies chroniques, la détermination des antigènes de surface est de peu d’utilité pour les leucémies myéloïdes chroniques dont le stade de différenciation est très caractéristique et dont le diagnostic est confirmé par la présence du chromosome Philadelphie résultant de la translocation t(9 ; 22).

Pour la leucémie lymphoïde chronique (LLC), qui représente la plus commune des leucémies adultes en Europe de l’Ouest et en Amérique du Nord, le phénotype de surface peut être utile.

Les antigènes de surface de la lignée lymphocytaire B sont typiquement exprimés comme CD19, CD20, l’Ig de surface (IgM ou IgD), CD43, CD79alpha avec dans tous les cas une coexpression de CD5.

L’antigène CD5 a été d’emblée identifié comme marqueur commun aux lymphocytes T et aux lymphocytes B de LLC puis il a été identifié sur une sous-population de cellulesBnormales dans le sang de cordon foetal, la rate et les ganglions, ainsi qu’à la périphérie des centres germinaux de ganglions adultes.

L’antigène CD23 est également exprimé dans les LLC ce qui permet de les distinguer des lymphomes à cellules du manteau qui sont CD23-.

L’antigène CD10 est absent, CD20 et CD22 sont faibles et CD11c et CD25 sont généralement exprimés mais faiblement.

Dans les leucémies prolymphocytaires B, généralement plus agressives, les cellules présentent une expression d’Ig de surface plus importante et sont le plus souvent CD5- avec une expression plus forte de CD22, ce qui permet de les différencier.

Dans l’identification des lymphomes, l’immunophénotype apporte une aide précieuse, mais là encore, c’est l’expression de tout un panel d’antigènes de surface qui doit être prise en compte.

Ainsi, les lymphomes à cellules du manteau (qui représentent 2 à 8 % des lymphomes) sont des néoplasmes clonaux de cellules B exprimant les antigènes de surface classiques : CD19, CD20, CD22 et CD43.

Le réarrangement clonal touche plus fréquemment la chaîne k que la chaîne j et ces cellules expriment relativement peu ou pas d’Ig à leur surface ; de plus, elles sont CD5+, CD23- et CD10-.

Elles sont donc faciles à distinguer des cellules de LLC.

Le profil d’expression des Ig de surface, associé à la présence de CD5 et à l’absence de CD23, permet la distinction avec les lymphomes folliculaires.

Ces derniers sont également caractérisés par une expansion clonale B, mais les cellules présentent dans ce cas beaucoup d’Ig à leur surface et n’expriment en revanche ni CD5, ni CD43, ni CD11c.

Ce dernier critère permet de les distinguer des cellules des lymphomes marginaux. Dans ce cas, les cellules présentent le phénotype de cellules B de zone marginale postfolliculaire : elles sont CD5-, CD10-, CD23- et le plus souvent CD11c+ mais n’expriment pas CD25.

Ces cellules pourraient être des cellules mémoires, ce qui expliquerait leur association avec des maladies auto-immunes : on observe en effet chez beaucoup de patients atteints de ce type de lymphome des antécédents de maladie auto-immune (du type thyroïdite de Hashimoto) ou de gastrite à Helicobacter.

Les leucémies à tricholeucocytes sont peu communes mais très bien caractérisées.

Les cellules tumorales expriment les antigènes de surfaceB : CD19, CD20, CD22, CD79alpha ainsi qu’une Ig de surface avec une restriction clonale au niveau de la chaîne légère.

Ces cellules sont souvent CD21-, elles expriment fortement CD11c et CD22 et plus faiblement CD25.

Ces caractéristiques indiquent un stade de différenciation B plus tardif que dans le cas des LLC.

L’antigène mucosal CD103 constitue le marqueur le plus net pour distinguer cette leucémie des autres leucémies B.

Il s’agit d’un antigène exprimé par les lymphocytes T intraépithéliaux ainsi que par certains lymphocytes activés ; il appartient à la famille des intégrines, dont il constitue la chaîne alphaE qui forme en général un hétérodimère avec la chaîne bêta7 et dont le ligand est la E-cadhérine, exprimée par les cellules épithéliales ce qui suggère un rôle possible de CD103 dans la domiciliation et la rétention des lymphocytes dans les épithéliums.

L’utilisation des antigènes de surface présente plus de difficultés dans les autres pathologies malignes.

Les myélomes multiples et autres désordres des plasmocytes sont difficiles à évaluer en cytométrie en flux du fait de la difficulté d’isoler la sous-population maligne.

La plupart des antigènes de surface de la lignée B sont perdus, sauf CD38 qui est fortement exprimé ; de plus, il existe des marqueurs caractéristiques du stade plasmocytaire comme l’antigène CD138 (ou syndecan-1) dont l’utilisation s’avère extrêmement utile dans le diagnostic.

Dans le cas des désordres périphériques T , les cellules présentent un phénotype de cellules T périphériques bien distinct du phénotype thymique observé dans les LAL T ou les lymphomes lymphoblastiques et se caractérisant essentiellement par la coexpression de CD3 avec l’un des marqueurs CD4 ou CD8, exclusivement.

Dans le cas de la leucémie T adulte associée à HTLV-1, les cellules présentent un phénotype de cellules T activées avec une forte expression de HLA-DR, de CD25 et également une surexpression de CD62-L (ou L-sélectine).

Dans le cas de la maladie de Hodgkin, la détermination des antigènes de surface est difficile compte tenu du fait que la grande majorité des cellules sont des cellules inflammatoires non malignes.

Toutefois, une analyse phénotypique des cellules de Reed-Sternberg a permis de rapporter la présence de marqueurs T dans environ 50 % des cas alors que les marqueurs B sont moins communs.

Ces cellules expriment de façon importante l’antigène CD30 (qui a été identifié la première fois à leur surface) : il s’agit d’un membre de la superfamille duTNFR (récepteur duTNF : tumor necrosis factor) dont le ligand est CD153.

L’interaction CD30-CD153 costimule la prolifération des lymphocytes T. D’autre part, les cellules de Reed-Sternberg surexpriment CD80 (ligand de CD28) et CD40.

2- Valeur pronostique des antigènes de surface et utilisation dans la détection de la maladie résiduelle :

La valeur pronostique de l’expression de certains antigènes de surface n’est pas clairement établie ; toutefois quelques corrélations ont pu être faites.

Ainsi, dans le cas des leucémies lymphoblastiques pré-B, un mauvais pronostic est corrélé à l’absence de CD10 et de CD34 ou de CD10 et de CD24 ou bien encore à l’expression de CD13 et CD33.

Dans le cas des LAL de l’enfant, l’absence de CD10 paraît être associée à un pronostic défavorable : il semble en fait que cela soit lié au fait que la fréquence d’une hyperploïdie avec plus de 50 chromosomes (qui constitue clairement un pronostic favorable) soit plus grande dans les cas de LAL CD10+.

Au contraire, la pseudoploïdie est présente chez la majorité des patients présentant une LAL pré-B CD10-.

Dans un des sous-types de LAM (M2 selon la classification FAB), l’expression de CD19 ainsi que celle, bien que moins fréquente, de CD56 sont associées avec la translocation t(8 ; 21), marqueur de pronostic favorable chez l’adulte.

En ce qui concerne la valeur pronostique de l’expression d’antigènes lymphocytaires dans le cadre de LAM de l’enfant, la situation est très controversée : pour certains, l’expression d’antigènes comme CD2 et CD19 associés à la lignée lymphocytaire présage d’un pronostic plus favorable alors que pour d’autres, elle ne semble avoir aucune valeur de cet ordre.

De façon générale, la valeur pronostique des données immunophénotypiques dans le cadre des LAM est controversée.

Pour la détection de la maladie résiduelle, les méthodes conventionnelles comme la morphologie cellulaire, la cytogénétique ou l’analyse par southern blot ont des sensibilités comprises entre 1 et 5 %.

La détection des réarrangements par la technique de PCR (polymerase chain reaction) permet d’atteindre une beaucoup plus grande sensibilité mais son utilisation n’est pas toujours possible.

La détermination d’antigènes de surface par des techniques de double marquage (ou plus) en immunofluorescence est un procédé qui permet de détecter jusqu’à une cellule néoplasique pour 103 à 104 cellules normales.

Cette méthode repose sur l’utilisation d’une combinaison d’antigènes de surface la plus spécifique et discriminante possible des blastes leucémiques.

Dans le cas des LLC, on peut ainsi utiliser l’expression de CD5 avec la monoclonalité de la chaîne légère de l’Ig de surface pour obtenir une sensibilité de 5 %et quand on associe l’un des marqueurs CD5, CD20 ou CD19 avec un marquage des deux chaînes légères j et k, on atteint une sensibilité inférieure à 1 %.

Dans le cas des LAL de lignée B, les cellules expriment CD19, CD10 et, pour une petite proportion de cas, CD34 : toute combinaison de ces marqueurs associée avec un marqueur aberrant comme CD13, CD33 ou CD15 permet d’identifier spécifiquement les cellules deLAL parmi des cellules de moelle osseuse normale ou des cellules de sang périphérique.

On peut noter que, d’emblée, l’utilisation du caractère quantitatif de la cytométrie en flux permet de distinguer les précurseurs B normaux des précurseurs B leucémiques ; en effet, les précurseurs normaux présentent moins de molécules de CD10 et CD19 que les blastes de LAL.

Pour les LAM, plusieurs combinaisons permettent également une identification sensible des blastes dans la plupart des cas.

Les cellules des leucémies à tricholeucocytes sont facilement identifiables, avec une sensibilité inférieure à 1 %, parmi les cellules circulantes en utilisant des doubles marquages avec CD103 et CD22 ou CD19 et CD11c ou CD25.

L’utilisation des antigènes de surface pour la détection de la maladie résiduelle constitue donc un outil intéressant souvent associé à la PCR, qui permet de révéler les réarrangements caractéristiques dans le cas des proliférations clonales.

B - Cas des pathologies non malignes :

Beaucoup de ces pathologies ont des caractéristiques tellement claires que le diagnostic ne nécessite pas un recours à la détermination d’antigènes de surface.

Toutefois dans certains cas, cette approche a permis d’élucider les caractéristiques d’une pathologie.

L’hémoglobinurie nocturne paroxystique est une pathologie rare dont le tableau clinique était connu depuis plusieurs décennies.

Cette affection résulte d’une sensibilité excessive des globules rouges à l’action du complément et on a pu montrer que celle-ci est liée à l’absence des protéines qui régulent négativement le complément à la surface des érythrocytes, c’est-à-dire CD55 et CD59.

C’est le déficit en ces deux antigènes de surface qui permet de diagnostiquer de façon claire la maladie.

Le point commun entre CD55 et CD59 est que ce sont deux protéines membranaires ancrées dans la bicouche lipidique par l’intermédiaire d’un pied glycophosphatidylinositol (GPI), dont la synthèse est affectée chez les patients atteints d’hémoglobinurie nocturne paroxystique.

Cette déficience résulte de la mutation du gène GPI-A localisé sur le chromosome X.

Différentes mutations ont été identifiées, qui se traduisent différemment en termes d’expression de CD59 et qui semblent intervenir à un stade relativement précoce de la différenciation hématopoïétique pour engendrer un clone qui prend le dessus sur tous les autres clones.

Ce clone donne naissance à toutes les lignées hématopoïétiques, et on trouve ainsi chez les malades des lymphocytes circulants présentant un déficit en molécules ancrées par un GPI (comme CD59).

Nous avons donc vu que la détermination des antigènes de surface portés par les cellules permet de préciser le diagnostic dans le cadre de différentes pathologies.

Dans le cadre des pathologies malignes, cette détermination est particulièrement utile et permet dans certains cas de déterminer l’équivalent « sain » de la cellule tumorale.

Elle peut également s’avérer intéressante pour la détection de la maladie résiduelle.

Utilisation des antigènes de surface dans la caractérisation et l’obtention de cellules souches hématopoïétiques :

L’existence de cellules souches hématopoïétiques est connue depuis les années 1950.

L’intérêt pour elles a pris un essor particulier dans le contexte des thérapies par greffe de cellules souches allogéniques puis maintenant autologues.

La caractérisation des cellules souches hématopoïétiques n’est toutefois pas encore parfaite puisqu’on ne parvient pas à obtenir la cellule véritablement souche, totipotente et capable d’autorenouvellement.

Néanmoins, un certain nombre de marqueurs sont connus comme étant des marqueurs de cellules pluripotentes et capables d’autorenouvellement donc capables d’assurer une reconstitution hématologique correcte chez des patients.

Le premier anticorps monoclonal ayant permis d’identifier et de purifier les cellules souches humaines de moelle osseuse a été MY-10, obtenu par immunisation avec une lignée myéloïde immature, KG-1a. Cet anticorps fut classé lors du IIIe Atelier sur les antigènes de différenciation des leucocytes humains avec BI-3C5 dans le cluster CD34.

Depuis, de nombreux anticorps dirigés contre cette molécule ont été obtenus et ont permis de confirmer que CD34 était un antigène de surface des cellules souches hématopoïétiques immatures mais également des cellules déjà engagées dans une lignée.

L’antigène CD34 est aussi présent sur les cellules endothéliales des petits vaisseaux et sur les fibroblastes embryonnaires.

Les cellules CD34+ de moelle osseuse ne représentent que 1,5 %des cellules mononucléées de la moelle et dans le sang, elles ne sont que 0,5 %.

La population exprimant fortement CD34 contient la plus grande part des cellules progénitrices hématopoïétiques immatures alors que les cellules déjà engagées dans une lignée expriment moins intensément l’antigène CD34 qui est une protéine transmembranaire de type I de 115 kDa fortement glycosylée, et qui ne montre aucune homologie avec d’autres protéines connues mais quelques parentés sont notables.

Ainsi, la région aminoterminale fortement glycosylée de CD34 est similaire à celle de CD43, une sialoglycoprotéine spécifique des cellules hématopoïétiques.

L’antigène CD43 paraît jouer un rôle à la fois dans l’adhésion et dans l’activation cellulaire bien que sa fonction précise soit inconnue ; CD34 présente également de faibles similarités avec d’autres molécules d’adhésion dont CD62L et CD62E.

De façon intéressante, certaines études révèlent que la L-sélectine (CD62L) ou une protéine proche pourrait être un ligand de CD34 ce qui pourrait expliquer la localisation des cellules souches CD34+ dans la moelle suite à un phénomène de homing impliquant dans un premier temps une interaction entre CD34 et CD62L puis une forte interaction mettant en jeu des intégrines au niveau du stroma ; CD34 serait alors impliquée dans l’adhésion des cellules hématopoïétiques au stroma de la moelle osseuse.

En ce qui concerne le rôle de CD34 dans la différenciation, les choses sont encore peu claires : il semble toutefois que la diminution de l’expression de CD34 soit nécessaire pour que la différenciation ait lieu.

Mais CD34 n’est pas un antigène exclusivement associé aux cellules souches hématopoïétiques les plus immatures ; aussi, la caractérisation de ces dernières a été améliorée en identifiant d’autres antigènes exprimés à leur surface.

Une équipe américaine a identifié une population candidate pour être celle des cellules souches hématopoïétiques humaines parmi des cellules de moelle osseuse portant l’antigène CD34 mais aucun des marqueurs de lignée : ces cellules sont alors appelées Lin-.

D’autre part, les cellules exprimant le marqueur Thy-1 avec CD34 montraient une plus grande fréquence d’initiation de cocultures à long terme que les cellules sans Thy-1.

Enfin, il apparaissait que cette population CD34+ Lin- Thy-1+ était capable de s’implanter dans une souris SCID humanisée et de générer des cellules de la lignée myéloïde et lymphoïde.

Un peu plus tard, une autre équipe a clairement établi que Thy-1 était exprimé sur les cellules souches hématopoïétiques humaines.

L’étude portait sur les cellules hématopoïétiques du foie, de la moelle osseuse et du sang de cordon foetaux : les cellules CD34+ Thy-1+ apparaissent comme les plus primitives du point de vue phénotypique et fonctionnel.

L’expression de Thy-1 est relativement faible sur les cellules CD34 et elle diminue avec l’engagement dans une voie de différenciation.

Depuis ces travaux, Thy-1 a été rangé dans la classe de différenciation CD90, qui est une protéine ancrée dans la membrane par un GPI.

Une autre molécule de ce type, CD109 est également sélectivement exprimée par la sous-population immature des cellules CD34+.

Deux autres marqueurs sont également uitlisés pour définir la population de cellules souches hématopoïétiques : il s’agit de CD38 et HLA-DR.

L’antigène de surface CD38 n’est pas exprimé par les cellules souches hématopoïétiques.

Un enrichissement notable en progéniteurs pluripotents est obtenu en éliminant des cellules CD34+ les cellules qui coexpriment CD38.

Et plusieurs articles établissent clairement que c’est seulement parmi la population CD34+ CD38- que se trouvent les cellules totipotentes.

En ce qui concerne l’antigène de surface HLA-DR, la situation est moins claire : dans le sang de cordon foetal, dans le foie foetal et dans la moelle osseuse foetale, les cellules coexprimant HLA-DR avec CD34 sont enrichies en cellules souches.

En revanche, dans la moelle adulte, les progéniteurs primitifs n’expriment pas HLA-DR.

Parmi les cellules de la moelle osseuse adulte, peu nombreuses sont celles qui sont doublement négatives pour CD38 et HLADR.

On peut donc définir deux sous-populations différentes : l’une CD34+CD38- et l’autre CD34+HLA-DR-, toutes deux sont enrichies en cellules souches hématopoïétiques avec toutefois un plus grand enrichissement dans la sous-population CD34+CD38-.

L’utilisation des mêmes marqueurs permet également de caractériser les cellules souches hématopoïétiques mobilisées dans le sang périphérique après administration de facteurs de croissance.

Il est ainsi apparu qu’il existe dans le sang périphérique une population de cellules CD34+ CD90+ Lin- qui montrent une activité hématopoïétique à long terme aussi bien in vitro qu’in vivo et ayant la capacité de générer des cellules myéloïdes et des lymphocytes T et B.

Un autre marqueur permettant de discriminer les cellules souches hématopoïétiques est le marqueur c-kit ou CD117.

Il s’agit d’un récepteur membranaire possédant une activité tyrosine kinase intrinsèque codé par le proto-oncogène c-kit.

Il est exprimé sur les cellules souches de la moelle osseuse mais il semble que les progéniteurs les plus primitifs n’expriment CD117 que faiblement à leur surface.

La population qui montre une forte expression de l’antigène c-kit est majoritairement celle des cellules progénitrices engagées dans la lignée granulomonocytaire ; puis, au fil de la maturation, l’expression de c-kit diminue et disparaît.

Le ligand de c-kit est connu : il s’agit du SCF (stem cell factor), facteur de croissance des cellules souches.

Il semble que la transduction du signal consécutive à l’interaction de CD117 avec son ligand joue un rôle important dans les stades précoces de l’hématopoïèse.

En réalité, toute une série d’antigènes de surface appartenant à la même famille de récepteurs tyrosine kinase que CD117 ont été identifiés : il s’agit de FLK-2/FLT-3, du produit du proto-oncogène c-fms, de TIE qui semblent tous jouer un rôle important dans la prolifération cellulaire.

Tous ces antigènes paraissent exprimés sur les cellules souches hématopoïétiques.

Ainsi, il a été montré qu’une grande partie de ces cellules sont CD34+CD38-TIE+ ; TIE possède dans son domaine extracellulaire des domaines du type immunoglobuline et des domaines d’homologie avec le facteur de croissance épidermique (EGF) ; c’est une protéine dont l’expression est aussi observée sur les cellules B.

Le ligand de TIE est inconnu et son rôle dans l’hématopoïèse précoce n’est pas établi.

Le facteur de croissance hématopoïétique FLT-3 joue un rôle clé dans la croissance des cellules souches hématopoïétiques.

Le récepteur de FLT-3 est un récepteur tyrosine kinase qui est exprimé sur les cellules hématopoïétiques normales et malignes.

L’homologue murin de ce récepteur, FLK-2, a clairement été identifié comme un récepteur tyrosine kinase spécifique des populations souches hématopoïétiques enrichies en progéniteurs.

Ce récepteur pourrait avoir un rôle déterminant dans la transduction du signal dans les cellules souches totipotentes et dans leur progénie immédiate.

CD135 (= le récepteur de FLT-3) est exprimé sur les cellules souches hématopoïétiques précoces et aussi sur les cellules engagées dans la lignée monocytaire mais le niveau d’expression reste toujours relativement faible.

Ce sont donc les cellules CD34+CD38- (ou faible) HLA-DR- CD117 faible qui expriment CD135.

De plus, l’expression de CD90 est essentiellement restreinte à la population CD135 faible.

Un troisième membre de cette famille de récepteurs tyrosine kinase, CD115 ou produit du proto-oncogène c-fms est également exprimé sur une sous-population de cellules souches hématopoïétiques : il semble toutefois que son expression soit plus restreinte aux cellules ayant un devenir dans la lignée monocyte/macrophage.

Plusieurs travaux rapportent que des anticorps monoclonaux dirigés contre l’antigène de surface récemment « clustérisé » CD164 (ou MGC-24v) ne reconnaissent pas seulement des tumeurs solides de différentes origines mais aussi les cellules précurseurs érythroïdes et la majorité des cellules de la moelle osseuse exprimant CD34.

L’antigène de surface CD164 est une molécule du type mucine qui avait été identifiée au départ sur une lignée de cellules de carcinome gastrique, il semble qu’elle agisse comme un régulateur négatif de l’hématopoïèse.

Récemment, un nouveau marqueur des cellules souches hématopoïétiques a été identifié grâce à un nouvel anticorps monoclonal : AC133.

L’antigène de surface reconnu présente une structure originale puisqu’il possède cinq domaines transmembranaires.

AC133 marque les populations progénitrices exprimant fortement CD34 dérivées de la moelle osseuse.

Contrairement à CD34, cet antigène n’est pas exprimé sur les cellules endothéliales de type HUVEC, ni sur la lignée KG-1a, ni sur les fibroblastes.

L’anticorps AC133 définit donc une population de cellules immatures et de cellules engagées dans la voie granulomonocytaire : cet antigène pourrait donc s’avérer utile dans la sélection des cellules souches hématopoïétiques en plus de CD34.

Dans le cadre de la recherche de nouveaux marqueurs, un nouvel anticorps monoclonal, AY19, a été obtenu : il reconnaît les cellules souches hématopoïétiques du sang de cordon foetal et définit les progéniteurs granulomonocytaires.

Enfin, un certain nombre d’antigènes sont utilisés pour déterminer l’engagement d’une cellule dans une voie de différenciation hématopoïétique. CD33 permet ainsi d’identifier les cellules engagées dans la voie myéloïde, CD64 est un marqueur de l’engagement granulomonocytaire, CD7 et CD19 permettent, respectivement, d’identifier les cellules engagées vers les lymphocytes T ou B.

L’analyse de l’expression de CD45RA, un des isomorphes de l’antigène CD45, permet de discriminer les progéniteurs myéloïdes de façon précoce : les cellules CD34+ myéloïdes précoces sont CD45+/RA- contrairement aux cellules myéloïdes qui sont CD45RA+ (fortement exprimé) et CD33+.

Le phénotype des cellules souches hématopoïétiques s’est donc notablement précisé depuis les premiers travaux avec CD34.

Il apparaît que celles-ci expriment un certain nombre d’antigènes : CD34, CD90, CD117, CD135, CD164, AC133 et au contraire n’expriment aucun antigène caractéristique d’une lignée hématopoïétique, ni les marqueurs CD38 et HLA-DR (pour les cellules souches de la moelle osseuse adulte).

En ce qui concerne l’obtention de cellules souches hématopoïétiques, elles sont actuellement essentiellement récupérées dans le sang périphérique après mobilisation (selon différents protocoles).

Des leucaphérèses sont donc réalisées et les cellules sont triées pour récupérer un maximum de cellules souches hématopoïétiques.

Le marqueur utilisé en routine est CD34 puisqu’il existe des colonnes sur lesquelles l’anticorps CD34 est adsorbé et qui permettent ainsi de retenir les progéniteurs CD34+ et d’éliminer les cellules tumorales.

Mais nous avons vu qu’il existe beaucoup d’autres marqueurs : il sera donc nécessaire pour augmenter le degré de purification d’utiliser plusieurs anticorps.

Actuellement, des colonnes utilisant une double sélection basée sur l’expression de CD34 et CD90 sont à l’essai. Une des questions actuelles est de savoir si l’antigène CD34 permet réellement d’identifier la cellule la plus primitive.

En effet, certains travaux récents tendent à montrer que la cellule souche la plus primitive ne porterait pas CD34 et serait vraisemblablement pauvre en antigènes de surface, ce qui rendrait sa caractérisation et sa purification extrêmement difficiles.

Les antigènes de surface permettent donc de diagnostiquer des pathologies et également d’identifier les cellules souches hématopoïétiques.

La détermination des antigènes de surface peut aussi avoir des applications dans le cadre de la thérapie génique.

En effet, on sait que le système immunitaire peut se révéler incapable de générer une réponse immune correcte contre des cellules tumorales.

Cela peut être dû à plusieurs défauts sur les cellules tumorales : une absence de molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), l’absence d’antigène tumoral, un défaut d’apprêtement des antigènes ou une absence de molécules de costimulation.

Un intérêt croissant se manifeste pour induire l’immunité antitumorale en introduisant de nouveaux gènes dans les cellules tumorales.

Une approche consiste à introduire les gènes codant pour des molécules de costimulation comme B7-1 (CD80) ou B7-2 (CD86).

Dans des modèles animaux, il est apparu que la transfection de CD80 dans une lignée de mélanomes induisait une immunité protectrice ; toutefois, dans d’autres modèles de tumeurs, l’introduction de CD80 n’a conféré aucune protection, ce qui suggère que l’efficacité de la transfection dépend du type de tumeur et vraisemblablement de son immunogénicité de départ.

Dans le cas des tumeurs hématopoïétiques, la transduction de molécules costimulatrices pourrait être bénéfique car ces cellules expriment fortement les molécules du CMH de classe I comme de classe II et sont capables, au moins dans certaines circonstances, de présenter un antigène mais la plupart d’entre elles sont déficitaires pour l’expression de CD80, CD86 ou les deux.

Dans un modèle murin de leucémie myéloïde aiguë, il a été montré que des cellules de LAM transduites avec le gène de CD80 et irradiées induisaient une immunité des souris pour une période de 5 à 6 mois contre des cellules de LAM administrées consécutivement.

De plus, l’injection de cellules de LAM CD80+ irradiées engendrait un rejet des leucémies chez des souris atteintes de stades précoces.

Il apparaît donc que la caractérisation des cellules tumorales en termes d’antigènes de surface impliqués dans l’induction d’une réponse immunitaire permettra de cibler les molécules à utiliser dans le cadre de la thérapie génique.

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