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Génétique
Problèmes de génétique chez la levure
Cours de Génétique
 

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Remarque. À ce stade du problème, cette dernière hypothèse n’est pas attendue parmi les réponses des étudiants, même si l’énoncé de la question précise que le génotype de A est « présumé ».

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4. Dans ce croisement, seuls les phénotypes tryptophane et lysine sont analysés, ce qui concerne dans chaque croisement trois gènes, les gènes TRP1, LYS2 et le gène suppresseur, nommé su1 dans RA1, su2 dans RA2 et su3 dans RA3. Dans chaque croisement le diploïde obtenu est de génotype :

où :

– le premier allèle est celui apporté par le révertant et le second allèle est celui apporté par la souche (met14-5, his2-3);

– n est le numéro du suppresseur (1, 2 ou 3), dans sa version allélique active (a) ou inactive, sauvage (i);

– les pointillés indiquent l’ignorance relative à une liaison génétique éventuelle du locus du suppresseur avec l’un des deux locus précédents (ceux-ci étant physiquement indépendants, voir énoncé).

À partir de ce génotype, et en considérant le gène suppresseur et le gène TRP1, quatre types de spores sont possibles :

– spore parentale : (trp1-3, sun a) de phénotype [trp+] pour n = 1, 2 ou 3,

– spore parentale : (trp1+, sun i) de phénotype [trp+] pour n = 1, 2 ou 3,

– spore recombinée : (trp1-3, sun i) de phénotype [trp–] pour n = 1, 2 ou 3,

– spore recombinée : (trp1+, sun a) de phénotype [trp?] pour n = 1, 2 ou 3. Si la spore recombinée (trp1+, sun a) avait un phénotype [trp–], on observait parmi les trois types de tétrades, des DR avec quatre spores [trp–], ce qui n’est pas le cas et montre que le phénotype est [trp+] À partir de ce génotype, et en considérant le gène suppresseur et le gène LYS2, quatre types de spores sont possibles :

– spore parentale : (lys2-4, sun a) de phénotype [lys+] pour n = 1, 2 mais pas pour n = 3, – spore parentale : (lys2+, sun i) de phénotype [lys+] pour n = 1, 2 ou 3,

– spore recombinée : (lys2-4, sun i) de phénotype [lys–] pour n = 1, 2 ou 3,

– spore recombinée : (lys2+, sun a) de phénotype [lys?] pour n = 1, 2 ou 3. Si la spore recombinée (lys2+, sun a) avait un phénotype [lys–], on observait parmi les trois types de tétrades, des DR avec quatre spores [lys–], ce qui n’est pas le cas et montre que le phénotype est [lys+]. L’analyse du tableau conduit alors aux conclusions suivantes : a. Le suppresseur su1 a de RA1 est :

– génétiquement indépendant de TRP1 (22 DR et 24 DP) et physiquement également (4 T, très inférieur à 2/3),

– génétiquement lié à LYS2 (34 DP, 4 DR), ce qui conduit à une distance génétique corrigée égale à 100(12/2 + 3 × 4)/50 = 36 u.r.,

– à une distance calculable de son centromère, car TRP1 étant centromérique, tous les tétratypes résultent d’une post-réduction entre le locus du suppresseur et son centromère; cette distance est égale à 100(4/50)/2 = 4 u.p.r. b. Le suppresseur su2 a de RA2 est :

– génétiquement indépendant de TRP1 (18 DR et 20 DP) et physiquement également (12 T, très inférieur à 2/3),

– génétiquement indépendant LYS2 (9 DP, 8 DR), sans qu’on puisse statuer sur l’indépendance physique puisque la fréquence des tétratypes est égale à 2/3,

– à une distance calculable de son centromère, car TRP1 étant centromérique, tous les tétratypes résultent d’une post-réduction entre le locus du suppresseur et son centromère; cette distance est égale à 100(12/50)/2 = 12 u.p.r.

c. Le suppresseur su3 a de RA3 est :

– génétiquement lié à TRP1 (38 DR et 2 Dr), ce qui conduit à une distance génétique corrigée égale à 100(10/2 + 3 × 2)/50 = 22 u.r., qui constitue aussi la distance du suppresseur à son centromère (voir remarque);

– génétiquement et physiquement indépendant LYS2, non par l’analyse de tétrades qui réunissent toujours deux spores [lys+] et deux spores [lys–], qu’elles soient DP, DR ou T, mais parce que su3 est lié à TRP1 qui, lui, est physiquement indépendant de LYS2 (voir énoncé). Remarque.

Si on calculait la distance de su3 à son centromère en considérant TRP1 comme marqueur centromérique, elle serait égale à 100(10/50)/2 = 10 u.p.r. et serait sous estimée, car on ne prendrait en compte, dans ce calcul, que la post-recombinaison issue d’un seul crossing-over. On peut présenter la cartographie suivante :

5.a. On a sept révertants où la chaîne peptidique du gène de structure ADA1 apparaît comme sauvage; comme il est difficile d’imaginer qu’on ait sept révertants vrais, il est logique de considérer que le mutant ada1-1 n’est pas muté dans le gène ADA1 mais dans un gène de régulation de ce gène de structure, par exemple dans le gène d’un activateur par une mutation de perte de fonction, ou dans le gène d’un répresseur, par un gain de fonction conduisant à un répresseur super actif. Remarque Pour pouvoir toucher le gène ADA1, on est parti de mutants (ade10-1, dea2-1), capables de pousser sur hypoxanthine et adénine, pour obtenir des mutants ayant perdu la capacité de pousser sur adénine. de tels mutants peuvent évidemment être mutés dans ADA1 mais peuvent aussi être mutés dans un autre gène, comme c’est ici le cas, ce qui montre bien que toute relation entre un phénotype et sa causalité génétique suppose une analyse fine !…et qu’un même phénotype peut recouvrir des réalités génétiques très différentes !

5.b. Si le révertant présente une chaîne peptidique active mais différente de celle du sauvage, c’est que le mutant est bien touché dans le gène de structure concerné (s’il était touché dans un gène de régulation de ce gène de structure, la chaîne peptidique du révertant serait sauvage, comme dans le cas précédent).

Ici, on peut conclure que la mutation ada1-2 est une mutation de décalage du cadre de lecture dans la séquence codante du gène ADA1, et que le révertant présente une mutation de recalage (décalage en sens inverse) légèrement en amont ou en aval du site de la mutation directe, de sorte que quelques acides aminés contigus sont modifiés dans la partie du cadre qui est demeurée décalée entre les deux sites, sans que cette modification altère la fonction de la chaîne peptidique.

5.c. Si la mutation nommée ada1-1 touchait le gène ADA1 et était alors allélique de la mutation ada1-2, le génotype du diploïde serait ada1-1 // ada1-2.

Étant par ailleurs homozygote ade10-1 // ade10-1 et dea2-1 // dea2-1, ce diploïde n’aurait pas la capacité de pousser sur adénine (pas de fonction désaminase), ce qui est le cas.

Mais, si les mutations ada1-1 et ada1-2 étaient alléliques, l’analyse de tétrades ne devrait alors donner que des spores [ade-] incapables de pousser sur adénine, ces spores étant toutes déficientes pour les fonctions ADA1 (ségrégation 2-2 des allèles ada1-1 et ada1-2), DEA2 et ADE10.

Or ce n’est pas le cas, ce qui confirme que ada1-1 et ada1-2 ne peuvent être alléliques. Comme on doit considérer (voir question a) que la mutation ada1-1 ne touche pas le gène ADA1 mais un autre gène, nommé R, le génotype du diploïde peut s’écrire :

R(ada-1-1) //R+ ----- ada1+//ada1-2

où :

– le premier allèle correspond à l’apport de la souche A et le second à l’apport de la souche B;

– l’allèle muté R correspond à l’allèle muté chez le mutant ada1-1;

– les pointillés indique l’ignorance quant à la liaison entre les locus des deux gènes.

Comme ce diploïde s’avère incapable de pousser sur adénine, on doit considérer que le phénotype [ade-] sur milieu Mo avec adénine est dominant, que l’effet de la mutation R(ada1-1) est dominant sur celui de l’allèle sauvage R+.

L’analyse de tétrades fait apparaître trois types de tétrades, ce qui est une nouvelle confirmation de l’absence de ségrégation 2/2 pour R(ada1-1) et ada1-2.

La méiose peut conduire à quatre types de spores :

– spore parentale : (R, ada+) de phénotype [ade–],

– spore parentale : (R+, ada1-2) de phénotype [ade–],

– spore recombinée : (R+, ada+) de phénotype [ade+],

– spore recombinée : (R, ada1-2) de phénotype [ade–] si on considère l’effet joint des deux mutations car l’analyse de tétrades donnerait des tétrades DR à quatre spores [ade+] si le phénotype n’était pas [ade–].

On a donc 17 DP et 18 DR, ce qui permet de conclure à l’indépendance génétique de ces deux gènes, et seulement 12 tétratypes (moins de 2/3) ce qui permet de conclure à leur indépendance physique.

La mutation ada1-1 n’affecte donc pas le gène ADA1 mais un autre gène R, physiquement indépendant de ADA1 et spécifiant vraisemblablement un répresseur de ADA1, de sorte que la mutation R (notée initialement ada1-1) serait un gain de fonction conduisant à la présence d’un répresseur sur-actif, dont l’effet serait dominant chez le diploïde.

Il serait logique de renommer la mutation ada1-1 en la désignant par R+++.

Chez les sept révertants RA4 à RA10, le phénotype [ade+] est recouvré par une mutation suppresseur de perte de fonction affectant le gène R et abolissant l’effet du répresseur suractif codé par l’allèle R+++.

Problème 10.9

On suppose, dans tout le problème, qu’on dispose des souches de signe sexuel, et des marqueurs de sélection des diploïdes adéquats.

La cellule de levure S. cerevisiae a besoin d’une grande quantité de phosphate pour sa croissance et sa multiplication (synthèse de ses acides nucléiques et des phospholipides).

Les sources de phosphate qu’elle utilise sont préférentiellement le phosphate inorganique libre externe (Pi) transporté tel quel dans la cellule par une perméase, ou le phosphate (Pi) libéré par clivage de composés organiques par des enzymes appelées phosphatases. Des phosphatases acides (pH3 ou 4 optimum), membranaires ou périplasmiques permettent l’utilisation de composés d’origine extérieure, la levure, comme tous les champignons, pouvant se développer en milieu très acide.

Des phosphatases alcalines cytoplasmiques (pH8 optimum) permettent le recyclage du phosphate à partir de métabolites phosphorylés.

On peut réaliser le dosage de l’activité phosphatase acide par une mesure d’activité spécifique (activité rapportée à 1 mg de protéine) et on peut réaliser la séparation électrophorétique de phosphatases de masse moléculaire et/ou de charge différentes (figure 1), qui sont mises en évidence par révélation spécifique de l’activité phosphatase acide dans le gel d’électrophorèse.

On a observé, chez S. cerevisiae, que l’activité enzymatique de type phosphatase acide est très élevée en conditions de carence en Pi inorganique dans le milieu extérieur, et très faible en présence de fortes concentrations dans le milieu.

Ainsi la souche de levure haploïde de référence SR1 a une activité de phosphatase de 30 unités d’activité spécifique en conditions de carence en Pi externe et de 2 unités d’activité spécifique, en présence de fortes concentrations en Pi externe (voir figure 1).

La souche SR1 est de génotype (his1–, trp1–), deux mutations d’auxotrophie responsables de phénotypes récessifs [his–] et [trp–]; le gène TRP1, marqueur de centromère, est situé assez près de son centromère pour que ses allèles soient toujours pré-réduits.

On se propose au vu des résultats biochimiques, d’entreprendre l’analyse des gènes impliqués dans cette activité phosphatase.

Question 1.

Dans des travaux précédents, on a pu isoler à partir de la souche SR1 quatre mutants, appelés PHO3, PHO5, PHO10 et PHO11, présentant une activité phosphatase acide réduite. Le phénotype muté est caractérisé à la fois par un dosage d’activité spécifique et par un profil électrophorétique de cette activité (voir plus haut et figure 10.4).

L’analyse génétique et biochimique de ces mutants a conduit aux résultats suivants :

– les diploïdes issus du croisement entre chaque mutant et une souche sauvage pour le phénotype phosphatase acide, sont de phénotype sauvage équivalent à celui de SR1 (voir figure 10.4);

– la sporulation de ces diploïdes conduit à deux types rigoureusement équifréquents de spores de phénotype sauvage (du type SR1, voir figure 1) ou de phénotype muté (voir figure 10.4);

– les croisements entre mutants donnent des diploïdes de phénotype sauvage.

Proposez, avec concision, aussi bien pour les mutants que pour la souche SR1, une interprétation exhaustive de ces résultats sur le plan génétique et biochimique : nombre de gènes identifiés, effets des mutations, expression des gènes en fonction du milieu, avec ou sans Pi.

Figure 10.4

– Profils électrophorétiques des activités phosphatases acides en fonction des différentes souches et de leur milieu de culture.

– À gauche, poids moléculaires correspondant aux différentes bandes, en dessous dosage de l’activité spécifique.

– Souche (de gauche à droite) : SR1 SR1 PHO3 PHO5 PHO10 PHO11

– Milieu de culture : sans Pi avec Pi sans Pi sans Pi sans Pi sans Pi – Activité Spécifique : 30 3 25 6 24 23

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