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Génétique
Problèmes de génétique chez la drosophile
Cours de Génétique
 

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Problème 11.2

Rappel : Définition et méthode d’analyse d’un marqueur moléculaire RFLP par southern blot. Le génome d’une espèce contient, dans sa séquence nucléotidique, des sites de restriction reconnus par des endonucléases.

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Certains de ces sites sont invariants et toujours présents. D’autres sont facultatifs et constituent un marqueur RFLP (polymorphisme de la longueur des fragments de restriction).

En effet, selon que le site est présent ou absent, l’action de l’endonucléase, à cet endroit du génome, générera deux fragments « courts » ou bien un seul fragment « long ».

L’analyse d’un marqueur RFLP peut être réalisée si on dispose d’une sonde génomique (marquée) ayant une partie commune avec au moins un des deux fragments, ou les deux fragments.

La procédure expérimentale consiste à effectuer une digestion totale de l’ADN génomique de l’individu étudié par l’endonucléase correspondant au site facultatif du marqueur analysé, puis à séparer les fragments par électrophorèse, à transférer ces fragments, après dénaturation, sur une membrane (southern blot), à hybrider ce southern blot avec la sonde marquée afin d’identifier la présence ou l’absence du fragment « long » ou des deux fragments « courts », ce qui permet d’en déduire le génotype de l’individu pour le marqueur RFLP analysé.

Une autre procédure peut être appliquée quand on dispose d’amorces spécifiques permettant d’amplifier par PCR le fragment génomique contenant le site facultatif.

Il suffit alors de faire agir l’endonucléase sur les produits de PCR et de visualiser la taille des fragments après électrophorèse sur un gel de polyacrilamide.

NB : Pour chaque marqueur RFLP, la présence du site facultatif est notée « + » et son absence « – ».

Les deux formes « alléliques » d’un marqueur mi seront donc notées mi+ et mi–, selon que le site facultatif relatif à ce marqueur est présent ou absent sur le fragment génomique testé.

On a réalisé, chez coli, une banque d’ADN génomique de Drosophila melanogaster, par clonage dans un plasmide, de fragments d’ADN génomique de drosophile.

Reprenant un à un quelques clones de cette banque, on a isolé trois clones, nommés S1, S2 et S3, dont les plasmides, utilisés comme sonde, se révèlent capables d’identifier trois marqueurs RFLP du génome de drosophile, notés m1, m2 et m3.

Pour étudier ces trois marqueurs, on extrait l’ADN d’individus de deux souches pures de drosophiles, A et B, et d’individus F1 issus du croisement A × B.

L’ADN extrait est réparti en trois fractions.

Chaque fraction est soumise à l’action d’une enzyme, TaqI, ou HindIII, ou EcoRI; puis les fragments de digestion sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose, dénaturés et transférés sur des membranes de nylon (southern-blot) qui sont respectivement hybridées par les sondes marquées S1 (pour les fragments TaqI), S2 (pour les fragments HindIII), et S3 (pour les fragments EcoRI).

Après lavage, les membranes sont autoradioagraphiées (si marquage radioactif) ou révélées (si marquage froid). Le pattern de fragments hybridés par les sondes est présenté à la figure 11.3.

1. Justifiez l’étape de dénaturation de l’ADN avant le transfert sur la membrane de nylon.

2. Pour chacune des souches (A, B et F1) vous définirez le génotype pour chacun des marqueurs RFLP (en utilisant la nomenclature définie au nota bene plus haut).

3. Pour chacune des souches (A et B) vous établirez une carte de restriction précise au locus de chacun des trois marqueurs RFLP, en mentionnant les sites invariants et le site facultatif, et en positionnant à chaque fois la sonde S par rapport aux fragments qu’elle reconnaît sur le southern.

4. L’ADN des mâles F1 présente, pour chaque marqueur, le même profil d’hybridation, que ce mâle soit issu d’un croisement mâle A × femelle B ou d’un croisement mâle B × femelle A.

Qu’en déduisez-vous ?

Qu’aurait-on dû observer dans le cas contraire ? Faites un schéma explicite (le seul cas m1 suffit).

5. Les individus F1 sont croisés entre eux et on entreprend l’analyse individuelle de l’ADN de 400 individus F2 (chaque individu est écrasé dans un tube et son ADN est extrait), afin d’établir le profil d’hybridation relatif à chacun des marqueurs m1, m2 et m3.

Pour chaque marqueur, on peut identifier un profil de type A (profil parental correspondant au premier profil sur les southern présentés plus haut), ou un profil de type B, ou un profil de type F1.

L’analyse de chaque marqueur considéré isolément donne les résultats suivants (tabl. 11.1).

a. Qu’en concluez-vous ?

Vous justifierez votre conclusion, pour le marqueur m3, par un test statistique.

b. Pourquoi, contrairement à des phénotypes morphologiques ou biochimiques, ce résultat était-il le seul possible ?

6. On a montré que les marqueurs m1 et m2 étaient physiquement indépendants. Vous ferez un schéma clair et précis de la méiose, chez la F1, pour ces deux marqueurs, montrant, sur le plan génétique, les différentes issues possibles de cette méiose (noter les « allèles » tels qu’indiqués dans le NB du rappel). Les centromères doivent obligatoirement figurer sur ce schéma.

7. On analyse à présent la ségrégation simultanée des profils d’hybridation pour les deux marqueurs m2 et m3.

Pour cela, on reprend les 400 individus F2, obtenus précédemment (dans le croisement F1 × F1 de la question 4); cela permet de les classer, selon que les profils observés, pour chacun des deux marqueurs, sont de type A, B ou F1 (tabl. 11.2).

a. Vous donnerez une interprétation cartographique précise de ces résultats pour les marqueurs m2 et m3.

Vos réponses doivent être justifiées, votre argumentation peut s’appuyer sur un schéma de la méiose.

Il vous est conseillé de faire un raisonnement fondé sur le taux r de recombinaison entre ces marqueurs (r = fréquence des gamètes recombinés), puis de faire l’application numérique.

b. Deux autres situations cartographiques étaient a priori possibles, lesquelles ?

Précisez, dans chacune de ces deux situations cartographiques, quelles auraient été les valeurs (en fréquences ou en %) en construisant un tableau semblable au tableau 11.2. Valeurs seuil du χ2 :

Solution

1. La dénaturation des fragments de restriction est nécessaire pour permettre l’hybridation moléculaire, au niveau des séquences homologues entre la sonde et les fragments de restriction issus de la digestion au niveau du locus du marqueur étudié.

NB : La sonde S1 reconnaît les deux fragments RFLP car elle a une partie commune avec chacun d’eux.

NB : La sonde S3 est homologue à une séquence interne au fragment de 2,0 Kb : elle hybride évidemment avec celui de 2,5 Kb, mais n’hybride pas avec celui de 0,5 Kb.

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