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Génétique
Génétique bactérienne
Cours de Génétique
 

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Problème 12.1

On dispose d’une souche A de coli auxotrophe pour la leucine, la proline, la thréonine, les purines, la cystéine, sensible au phage Tx, incapable de pousser sur galactose et résistante à la streptomycine. On dispose de la Hfr H, résistante au phage Tx et sauvage pour le reste du génome.

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NB : La mutation de résistance à la streptomycine est à la 72e minute de la carte standard.

1. On réalise un croisement par conjugaison H × A.

Toutes les cinq minutes on prélève quelques ml de la coculture qu’on agite avant de les répartir par étalement sur plusieurs boîtes afin de tester, individuellement, le phénotype de la réceptrice pour chacun des marqueurs.

a. Quel sera le milieu de culture permettant de tester les recombinants [pro+] ?

b. Quel sera celui permettant de tester les recombinants [gal+] ? 2. Interprétez les résultats (tabl. 12.1) pour chacun des phénotypes étudiés (schéma souhaité).

3. On laisse la conjugaison se poursuivre environ 70 minutes et on sélectionne les réceptrices [pur+, strR].

Testées par répliques, 80 % d’entre elles sont [gal+], 30% sont [cys+]. Testées par répliques, 95 % des [gal+] sont [txR], 50 % des [cys+] sont [TxR]. Interprétez ces résultats, en précisant le rôle du marqueur gal. Schéma indispensable.

4. On dispose d’une souche B, incapable de métaboliser le galactose et résistante à la streptomycine. Après croisement de B avec la Hfr H, on obtient des [gal+, StrR] après 14 min de conjugaison.

On prépare un lysat de phage transducteur P1 à partir de la souche Hfr et on transduit les souches A et B afin d’obtenir des recombinants [gal+]. 95% des recombinants [gal+], issus de la transduction de A par P1, sont [TxR], 100 % des recombinants [gal+], issus de la transduction de B par P1, sont [txS].

Discutez de la cohérence de ces résultats et concluez.

5. La souche Do de coli est sensible à la streptomycine et délétée pour le fragment du génome porteur de la région gal, pyr, Tx précédemment étudiée; elle est de phénotype [gal–, pyr–, TxR].

Par ailleurs, on dispose d’une souche, notée D, dont le génome correspond à celui de Do additionné d’un épisome contenant cette région à l’état sauvage.

La souche D est de phénotype [gal+, pyr+, TxS].

On obtient par traitement aux rayons X, des mutants résistants au phage Tx.

a. Discutez du phénotype de la souche D.

La mutagenèse et la sélection des mutants ont été réalisées en milieu glucose complémenté en pyrimidine.

Expliquez pourquoi.

b. Deux de ces mutants, notés D1 et D2 sont croisés avec les dérivés (strR, recA–) des souches d1, d2, d3 et d4.

On étale sur milieu M0 (glu) + pyr + streptomycine et on réplique sur milieu M0 (glu) + streptomycine ou M0 (gal) + pyr + streptomycine.

On rappelle que la perte de fonction recA entraîne l’incapacité de réaliser des recombinaisons homologues. Interprétez les résultats obtenus (tabl. 12.2).

Un schéma est demandé.

c. On réalise un lysat de phages transducteurs P1 sur le mutant D2 avec lequel on transduit les mutants m1 et m3.

On obtient des colonies sur milieu M0(gal) dans le premier cas, et jamais dans le second.

Concluez, en précisant la cohérence avec la carte fine des mutations gal (schéma souhaitable).

Solution

1. a. M0 (glu) complémenté en leucine, thréonine, purines et cystéine + streptomycine, celleci servant à contre-sélectionner les donatrices Hfr (voir page 235).

b. M0 (gal) complémenté en leucine, proline, thréonine, purines et cystéine + strepto.

2. Par un protocole de conjugaison interrompue, on a pu établir la carte suivante en temps de conjugaison, jusqu’au marqueur gal, les autres ne pénétrant qu’après 30 minutes.

3. En laissant conjuguer 70 minutes, on est sûr que les réceptrices sont restées [strR]. Les réceptrices étant toutes [pur+], on juge à présent du gradient de transfert à partir de cette nouvelle origine.

La fréquence des recombinants [pur+, gal+] étant supérieure à celle des [pur+, cys+], on peut en conclure que le marqueur gal est plus proche de pur que cys.

Le marqueur gal sert de référence pour juger du cotransfert/ de la corecombinaison du marqueur Tx.

Comme 95 % des recombinants [pur+, gal+] sont [TxR], on peut en déduire que les deux locus sont très proches mais il n’est pas possible de les situer par rapport à gal, car le cotransfert est un test de liaison et non un test trois points d’orientation.

D’où la carte suivante.

4. Si on obtient des recombinants [gal+, StrR] après 14 min, c’est que la souche B est mutée pour un autre gène gal que la souche A, qui seront notés respectivement galB et galA.

Ces deux locus sont donc à plus de seize minutes, soit plus de 640 000 pb.

Logiquement, dans ces conditions, le lysat transducteur de la séquence sauvage du gène galA cotransduit la séquence de résistance au phage Tx, alors que le lysat transducteur de la séquence sauvage de galB ne cotransduit jamais cette séquence de résistance.

Les gènes galA et Tx sont distants de beaucoup moins de 100 000 pb puisque leur taux de cotransduction est très élevé.

5. a La délétion chromosomique de la souche Do pour les gènes impliqués dans les phénotypes de métabolisation du galactose, de biosynthèse des pyrimidines et de sensibilité au phage Tx, constitue, pour ces gènes des mutations de « perte de fonction ».

Cette observation montre notamment que le phénotype de résistance au phage Tx résulte d’une perte de fonction du gène Tx (par exemple, si ce gène code pour une protéine jouant le rôle de récepteur au phage, comme la perméase au maltose pour le phage λ).

Le phénotype de la souche D étant [gal+, pyr+, TxS], on peut en déduire que, pour chacun de ces gènes, les mutations de perte de fonction ont un effet récessif par rapport à celui de chacun de leurs allèles sauvages respectifs. Les rayons X sont souvent utilisés pour générer des délétions.

Si une délétion affecte le gène Tx de l’épisome, elle va donner un phénotype de résistance puisque l’autre copie du gène est aussi délétée, mais il est possible que certaines délétions puissent s’étendre dans les gènes pyr et/ou gal ce qui conduirait respectivement à un phénotype d’auxotrophie pour les pyrimidines et/ou d’incapacité de croissance sur galactose, ce qui justifie un milieu glucose + pyrimidines.

5. b Les croisements effectués (par transfert de l’épisome d’une souche donatrice vers une réceptrice, sexduction) permettent d’obtenir des diploïdes partiels pour la région gal-Tx-pyr.

Le génome des réceptrices porte des mutations gal– et pyr–, elle est sauvage TxS (voir plus haut).

Le génome partiel apporté par l’épisome porte une mutation TxR, sans doute une délétion, mais doit être testé pour l’éventuelle extension de celle-ci d’un côté vers le (ou les) gène(s) gal, et de l’autre vers le (ou les) gène(s) pyr.

En effet, la cartographie de mutations (figure 9.5) ne permet pas de savoir si elles affectent un même gène ou pas. Les milieux de répliques sont précisément destinés à tester l’auxotrophie pour les pyrimidines et la capacité de croissance sur galactose.

On peut en conclure que l’épisome du mutant D1, étant capable, par son transfert à toutes les réceptrices d1, d2, d3 ou d4, de leur donner le phénotype [pyr+] n’est pas muté dans le (ou les) gènes de biosynthèse des pyrimidines.

En revanche, il doit être affecté d’une délétion s’étendant du gène Tx vers le (ou les) gènes gal (fig. 12.1).

On peut en conclure que l’épisome du mutant D2, étant incapable, par son transfert à toutes les réceptrices d1, d2, d3 ou d4, de leur donner le phénotype [pyr+] est muté dans le (ou les) gènes de biosynthèse des pyrimidines et doit être affecté d’une délétion s’étendant du gène Tx vers le (ou les) gène(s) pyr (fig. 12.1).

Par ailleurs, le fait que certains diploïdes soient [gal+] alors que d’autres sont [gal–] prouve qu’il ne peut y avoir dans cette zone un seul gène gal. Si c’était le cas, toutes les transformées seraient [gal–].

Il y a donc au moins deux gènes A et B et les phénotypes [gal+] résultent d’une complémentation fonctionnelle (fig. 12.1) :

• Les mutations m2 et m4 ne touchent pas le même gène que celui touché par la mutation (délétion) affectant l’épisome (les mutations m2 et m4 pouvant d’ailleurs affecter le même gène ou deux gènes différents).

• Les mutations m1 et m3 affectent un même gène A (ou éventuellement deux gènes contigus), dont le locus est proximal au locus Tx, puisqu’il n’y a pas de complémentation fonctionnelle avec la mutation affectant l’épisome.

Remarque. La délétion D1 touche les gènes A et B, mais on ne sait pas si elle couvre les sites des mutations m2 et/ou m4.

La délétion D2 touche le gène A, comme m1 ou m3, d’où l’absence de complémentation fonctionnelle, mais on ne sait pas si elle couvre les sites des mutations m1 et/ou m3.

5. c Par cette transduction, on permet précisément à la recombinaison moléculaire de pouvoir générer des séquences sauvages dans le cas où la délétion ne couvre pas le site de mutation sur l’autre génome.

C’est le cas avec la mutation m1, jamais avec la mutation m3.

Ce résultat apporte deux informations :

– c’est, d’une part, la confirmation que le mutant D2 est bien un mutant par délétion, car s’il avait été ponctuel, des recombinants eussent été possibles;

– d’autre par, cette délétion couvre le site m3 et non m1, ce qui est cohérent avec la carte qui a montré que m1 est distal de m3 par rapport à Tx.

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