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Génétique
La cartographie et carte fine des gènes
Cours de Génétique
 

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La cartographie fine par test multipoint :

Ordonner des gènes ou des sites sur un axe peut être réalisé par le calcul de leurs distances respectives, ce qui suppose que le nombre de gamètes étudiés est d’autant plus élevé que les distances sont courtes.

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Si les conditions expérimentales limitent ce nombre et ne permettent pas d’estimer avec précision les distances, il peut être utile de définir un test, plus qualitatif que quantitatif, fondé sur l’observation d’un type particulier de gamètes dans des croisements parallèles, les souches croisées étant définies de manière telle que ce gamète sera très rarement, voire jamais formé dans un des croisements. Supposons que trois sites de mutations d’un même gène, notés s1, s2 et s3 doivent être ordonnés, trois ordres sont possibles selon que s1 ou s2 ou s3 est central.

Dans un tel but on peut, à condition d’en disposer, faire trois croisements parallèles entre un double mutant pour deux des sites et le simple mutant pour le troisième, et observer lequel des croisements ne donne jamais de gamètes sauvages; on peut alors en conclure que le site du mutant simple de ce croisement est le site central (tabl. 6.1).

Ce genre de croisement et de test des gamètes est assez facile chez la levure où des milliers de spores peuvent être déposées sur une boîte où seules les sauvages peuvent donner des colonies, ou chez la drosophile si un test cross permet aux seules sauvages F2 de se développer.

Il existe des variantes plus simples, notamment quand on ordonne deux à deux les sites d’un même gène par rapport à une mutation externe responsable d’un phénotype différent, pouvant lui-même servir de crible de sélection (voir exercice d’application et de génétique bactérienne); dans ce cas il y a deux cartes possibles (le marqueur externe ne pouvant être central) et il convient de comparer les résultats de deux croisements.

TABLEAU 6.1 TEST TROIS POINT PERMETTANT D’ORDONNER LES MARQUEURS. Le but est d’identifier, en fonction de l’ordre possible des 3 marqueurs, le croisement entre doubles et simples mutants où la formation d’un gamète sauvage est la plus rare, parce qu’exigeant un double crossing-over.

On peut enfin définir un test quatre points où on ordonne deux à deux des sites de mutations en les positionnant par rapport à deux mutations extérieures situées de part et d’autre (voir exercices).

La plupart du temps, ces tests nécessitent de comparer entre eux les résultats de plusieurs croisements parallèles, ce qui n’a de sens que si les observations ne dépendent que de la position des sites et d’aucun autre paramètre; on verra que dans certaines conditions, avec des marqueurs de sélection supplémentaires, on peut raisonner à l’intérieur d’un seul croisement et s’affranchir ainsi des paramètres qui, en dehors de la position des sites, sont susceptibles de jouer sur l’efficacité du croisement à générer les recombinants (voir exercice de génétique bactérienne).

Exercices :

Exercice 6.1

En 1986, le gène humain impliqué dans la mucoviscidose, appelé depuis CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) n’avait pas encore été cloné et sa fonction était encore inconnue, même si elle était suspectée (canal ionique chlorure).

Par analyse de liaison génétique, on a montré que le gène CFTR était lié (distance égale à 15 cM) à un marqueur polymorphe de l’ADN dont les fragments de digestion (par l’enzyme Hinc II) sont reconnus par une sonde spécifique LAM4-917, mais ce marqueur polymorphe, nommé DOCRI- 917 n’était pas encore lui-même assigné à un chromosome.

On a alors extrait l’ADN de plusieurs lignées hybrides homme-rongeur qu’on a digéré par Hinc II; les fragments ont été ensuite séparés par électrophorèse puis transférés, après dénaturation de l’ADN, sur une membrane de nylon; ces Southern blot ont été hybridés par la sonde marquée LAM4-917 (tabl. 6.2, colonne a).

Par la suite, on a réhybridé les Southern blot par une autre sonde marquée, TCRB, correspondant à la séquence du gène du récepteur β de lymphocyte T (tabl. 6.2, colonne b), localisé sur le chromosome 7. Interprétez ces résultats en justifiant les choix de sondes.

TABLEAU 6.2 ASSIGNATION CHROMOSOMIQUE DU GÈNE CFTR. Colonne a, signal d’hybridation de l’ADN des lignées avec la sonde LAM4-917; colonne b, signal d’hybridation avec la sonde TCRB. (+) indique un signal d’hybridation et (–) son absence.

Solution. Le but de ce protocole est d’assigner le gène CFTR à un chromosome en assignant le marqueur DOCRI-917 qui lui est génétiquement donc physiquement lié.

Le gène CFTR ne peut être directement utilisé pour cette localisation, puisque sa séquence est indisponible, le gène n’étant pas encore cloné, et que son produit encore inconnu ne peut être dosé dans des extraits acellulaires de cellules hybrides.

On attend, de l’hybridation avec la sonde, un signal positif si le chromosome porteur de DOCRI-917 est présent, et l’absence de signal s’il est absent.

L’incohérence de résultat pour un chromosome donné (signal d’hybridation présent en absence de ce chromosome chez l’hybride cellulaire, ou signal d’hybridation absent en présence de ce chromosome) exclut alors ce chromosome comme porteur du marqueur DOCRI-917 et donc du gène CFTR.

La sonde LAM4-917 donne un signal d’hybridation avec l’ADN des lignées 3, 4 et 5 et un signal négatif avec les autres.

Si on considère les chromosomes conservés ou perdus par les différentes lignées, les résultats observés sont toujours incohérents, sauf avec le chromosome 7, ce qui permet de localiser DOCRI-917 et le gène CFTR sur le chromosome 7.

L’hybridation avec le gène TCRB joue le rôle de contrôle, montrant que les Southern blot répondent bien de façon attendue, positive ou négative, à l’hybridation d’une séquence connue pour être localisée sur le chromosome 7.

Exercice 6.2

On a isolé un mutant albinos dans une lignée pure de souris nommée CD1.

Une étude génétique a permis de montrer que ce mutant était récessif et muté dans un seul gène (3/4 de sauvage et 1/4 d’albinos à l’issue d’un croisement F1 × F1).

On souhaite « assigner » ce gène à un chromosome, c’est-à-dire identifier le chromosome où réside le locus de ce gène.

Dans ce but, on croise des mutants albinos de la lignée CD1 avec des individus de la lignée 129, sachant que ces deux lignées diffèrent l’une de l’autre pour de nombreux marqueurs VNTR identifiés et cartographiés.

Les marqueurs VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) sont des séquences d’ADN formées d’un nombre variable d’un motif répété, souvent un di ou un trinucléotide.

Ce « polyallélisme » génère dans une population naturelle un grand nombre de génotypes différents les uns des autres et entre eux, ce qui constitue la base des méthodes d’empreintes génétiques.

Dans les lignées pures de souris, tous les individus sont homozygotes pour un allèle du marqueur mais les lignées diffèrent les unes des autres, les individus n’étant pas homozygotes pour le même allèle du marqueur.

Les F1 sont croisées entre elles et on récupère les F2 albinos; on entreprend alors une « revue génomique » (génome scan) qui consiste à déterminer, pour tous ces individus, le génotype dont ils sont porteurs pour toute une série de ces marqueurs moléculaires répartis sur les différents chromosomes, dont les marqueurs D4M24, D5M8 et D7M52 (tabl. 6.3).

– D4M24 est le marqueur 24 du chromosome 4, les individus CD1 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 32 répétitions, les individus 129 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 22 répétitions;

– D5M8 est le marqueur 8 du chromosome 5, les individus CD1 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 8 répétitions, les individus 129 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 12 répétitions;

– D7M52 est le marqueur 52 du chromosome 7, les individus CD1 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 9 répétitions, les individus 129 étant homozygotes pour l’allèle porteur de 17 répétitions.

TABLEAU 6.3 GÉNOTYPES DES TROIS MARQUEURS VNTR ÉTUDIÉS DES F2 DE PHÉNOTYPE ALBINOS. Les allèles de chacun des marqueurs sont définis par leur nombre de répétitions, (entre parenthèses, effectifs observés de chacun des génotypes).

Sur quel chromosome peut-on assigner la mutation albinos de la lignée CD1 ? Justifier les réponses par un schéma.

Solution. La méthode consiste à assigner un gène à un chromosome en montrant qu’il est génétiquement lié à un marqueur moléculaire connu de ce chromosome. Les croisements entre albinos CD1 et non-albinos 129 génère des hétérozygotes pour tous les gènes, et notamment les marqueurs, dont l’allèle est différent d’une lignée pure à l’autre; c’est le cas pour le gène impliqué dans l’albinisme, dont les allèles seront notés A et a, comme pour les trois marqueurs étudiés.

Le génotype des F1 est figuré ci-dessous; les pointillés désignent une éventuelle liaison avec l’un des trois marqueurs (les trois étant physiquement indépendants entre eux) :

En cas d’indépendance génétique entre le couple d’allèles A/a et un marqueur donné, les F2, qu’ils soient A//A, A//a ou a//a seront, pour le marqueur considéré, homozygotes pour l’un des allèles avec une probabilité égale à 1/4 et hétérozygotes avec une probabilité égale à 1/2.

C’est effectivement ce qu’on observe pour D4M24 et D7M52; attention cette observation, en elle-même ne permet pas d’exclure que le gène A soit sur le chromosome 4 ou sur l7, mais permet d’exclure qu’il soit sur le 4, dans le voisinage de D4M24 et sur le 7, dans le voisinage de D7M52.

N’oublions jamais que deux gènes ou marqueurs peuvent être physiquement liés tout en étant génétiquement indépendants.

En cas de liaison génétique entre le couple d’allèles A/a et un marqueur donné, les allèles A auront tendance à coségréger, à la méiose chez la F1, avec l’allèle marqueur du parent 129, et les allèles a auront tendance à coségréger avec l’allèle marqueur de la lignée CD1.

En conséquence, les albinos F2, de génotype a//a, seront beaucoup plus souvent homozygotes pour l’allèle CD1, parfois hétérozygotes, et plus rarement homozygotes pour l’allèle 129, puisqu’alors ils seraient issus de deux gamètes, paternel et maternel, résultant tous deux d’un crossing-over entre le gène et le marqueur.

C’est ce qu’on observe pour le marqueur D5M8; on peut en conclure que la mutation albinos de CD1 touche un gène du chromosome 5, dans le voisinage du marqueur D5M8.

Exercice 6.3

Dans tout l’exercice, on ne tiendra pas compte du type sexuel, a ou α, des souches de levure Saccharomyces cerevisiae, on suppose qu’on dispose toujours d’une souche du type sexuel requis pour le croisement, ainsi que des marqueurs de sélection des diploïdes.

On dispose d’une souche haploïde A, auxotrophe pour l’isoleucine et la valine, phénotype noté [ilv–] deux acides aminés dont la chaîne de biosynthèse comprend une partie commune, et d’une souche B, auxotrophe pour la méthionine, phénotype noté [met–].

1. On réalise le croisement de A par B puis on étudie les spores issues de la méiose des diploïdes; on observe 4 250 spores [ilv–], 4 230 spores [met–], 140 spores [ilv–, met–] et 120 spores [ilv+, met+]. Quelles conclusions peut-on en tirer ?

2. À partir de la souche A, on a isolé un grand nombre de mutants indépendants, auxotrophes pour le tryptophane, phénotype noté [trp–]; on étudie quatre mutants nommés t1, t2, t3 et t4.

– Les quatre mutants sont croisés avec la souche B, les diploïdes sont sauvages.

– Les quatre mutants sont croisés deux à deux, les diploïdes sont tous [trp–].

Que conclure ?

3. Les diploïdes issus du croisement du mutant t1 avec B sont mis à sporuler.

On étale environ 10 000 spores sur des boîtes de milieu Mo additionné de tryptophane, de méthionine, de valine et d’isoleucine; 4 980 colonies sont capables de pousser, après réplique sur Mo additionné de méthionine, de valine et d’isoleucine.

On obtient des résultats sans différence significative avec les autres mutants t2, t3 et t4. Concluez.

4. Parmi ces 4 980 colonies, 4 836 se révèlent [ilv+, met–], 69 sont [ilv+, met+], 73 sont [ilv–, met–] et 2 sont [ilv–, met+]. Donnez la disposition des gènes entre eux sans faire de calculs mais en détaillant le génotype du diploïde dont sont issues les spores étudiées.

5. À partir des croisements précédents t3 × B et t4 × B, on a pu isoler des spores de phénotype [met–, trp–, ilv+] qui sont respectivement nommées t3′ et t4′. Précisez leur génotype.

On croise chaque mutant t1 et t2 avec chaque mutant t3′ et t4′; les diploïdes sont mis à sporuler et on étale environ 10 000 spores issues de chacun des croisements sur des boîtes de milieu Mo additionné de méthionine, de valine et d’isoleucine.

Par réplique on teste les colonies alors obtenues pour les phénotypes [ilv] ou [met]. Interprétez les résultats (tabl. 6.4).

TABLEAU 6.4 EFFECTIFS DES COLONIES CAPABLES DE POUSSER SUR CHACUN DES MILIEUX DE RÉPLIQUE À PARTIR DE BOÎTES MÈRES CONTENANT 10 000 COLONIES ISSUES DES SPORES OBTENUES À PARTIR DES QUATRE CROISEMENTS ANALYSÉS.

– Cartographie de gènes chez la levure Saccharomyces cerevisiae par test trois points.

– Carte fine des sites par test quatre points.

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