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Génétique
Analyse génétique des révertants et des suppresseurs
Cours de Génétique
 

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Exercice 7.5

On supposera, pour chaque croisement, qu’on dispose des souches de signe sexuel adéquat. Le cytochrome a/a3 occupe la position terminale de la chaîne respiratoire dont l’iso1 cytochrome c, ou l’iso2 occupe le cinquième rang (exercice 7.2); il n’a pas d’isoenzyme.

1. Le mutant cyc1-76 (mutant ambre UAG du gène de structure de l’iso1cytochrome c), a été isolé à partir d’une souche A de génotype (his1, met14).

Dépourvu d’iso1cytochrome c, il ne peut pousser sur lactate, mais peut, grâce aux 5 % d’iso2 pousser sur glycérol (voir ex. 7.2); il est donc de phénotype [gly+; lct–; his–; met–].

Ce mutant est croisé avec la souche C de génotype (trp1-4, pet17, ade2-1), où :

– trp1-4 est une mutation du gène trp1, conduisant à un phénotype [trp–];

– pet17 une mutation du gène de structure du cytochrome a/a3, donnant un phénotype [gly– ; lct–];

– ade2-1 une mutation du gène ade2, conduisant à un phénotype [ade–].

a. Quel est le rôle des mutations d’auxotrophie ?

b. Après méiose des diploïdes, on obtient les asques suivants :

– 5 tétrades avec 2 [gly+, lct+] et 2 [gly–; lct–]; – 6 tétrades avec 2 [gly+, lct–] et 2 [gly–; lct–];

– 9 tétrades avec 1 [gly+, lct+], 1 [gly+, lct–] et 2 [gly– ; lct–].

Interprétez ces résultats après avoir explicité le génotype des différents types de spores présentes dans chaque type d’asques.

La rédaction doit se fonder sur un schéma clair du génotype du diploïde.

c. Comment isoler, sans étude complémentaire, une spore S de génotype (cyc1-76; pet17) ?

2. À partir du mutant cyc1-76, on a isolé 21 révertants [gly+, lct+], restés de phénotype [his–, met–], dont 12 ont fait l’objet d’une première étude (exercice 7.2) et 9 autres, parmi lesquels on se propose d’étudier les révertants R1 et R3.

TABLEAU 7.8 TYPE ET NOMBRE DE TÉTRADES OBSERVÉES POUR LE PHÉNOTYPE LACTATE, À PARTIR DES DIPLOÏDES ISSUS DES CROISEMENTS D’UN RÉVERTANT R1 OU R3 AVEC LA SOUCHE D.

Ces 2 révertants sont croisés avec la souche D de génotype (trp1-1, lys1-1) de phénotype [gly+, lct+, trp–, lys–]; les diploïdes sont de phénotype sauvage pour tous les phénotypes.

Tous les asques présentent deux spores sauvages et deux spores mutantes pour chacun des caractères d’auxotrophie. Interprétez les résultats obtenus pour le phénotype lactate (tabl. 7.8) de manière claire, concise et complète, d’un point de vue fonctionnel et cartographique.

3. On croise chacun des révertants R1 et R3 avec la souche S issue de la spore isolée à la question 1.c; cette souche est, par ailleurs, auxotrophe pour le tryptophane et l’adénine.

a. Après la méiose, on observe 40 tétrades obtenues, pour les phénotypes glycérol et lactate (tabl. 7.9).

Comment interprétez-vous ces résultats ?

Quelle hypothèse pouvez-vous ou devez-vous faire sur le mode d’action de chacun de ces deux révertants ?

TABLEAU 7.9 TYPE DE TÉTRADES OBSERVÉES, POUR LES PHÉNOTYPES GLYCÉROL ET LACTATE, À PARTIR DE 40 DIPLOÏDES OBTENUS PAR CROISEMENT D’UN RÉVERTANT R1 OU R3 AVEC LA SOUCHE S.

b. Ces 40 tétrades sont également testées pour le phénotype tryptophane (tabl. 7.10), et pour le phénotype adénine (tabl. 7.11).

TABLEAU 7.10 TYPE DE TÉTRADES OBSERVÉES, POUR LE PHÉNOTYPE TRYPTOPHANE, À PARTIR DES 40 DIPLOÏDES OBTENUS PAR CROISEMENT D’UN RÉVERTANT R1 OU R3 AVEC LA SOUCHE S.

TABLEAU 7.11 TYPE DE TÉTRADES OBSERVÉES, POUR LE PHÉNOTYPE ADÉNINE, À PARTIR DES 40 DIPLOÏDES OBTENUS PAR CROISEMENT D’UN RÉVERTANT R1 OU R3 AVEC LA SOUCHE S.

– En quoi ces résultats confirment-ils les résultats de la question précédente 3.a. ?

– Quelle précision apportent-ils sur la mutation pet17 ?

– Quelle précision apportent-ils sur certaines des mutations d’auxotrophie ?

– Analyse de révertants, mise en évidence des suppresseurs.

– Analyse cartographique et fonctionnelle des suppresseurs.

NB : problème adapté d’un TD conçu par C. Isnard/J. Deutsch/D. Cohen (université Paris VI) à partir des travaux de J. Verdière (CNRS/Gif s/Yvette).

Solution

1. a Les mutations d’auxotrophie sont des marqueurs de sélection de diploïdes, par complémentation fonctionnelle, mais elles peuvent éventuellement servir à l’analyse fonctionnelle des suppresseurs (exercice 7.1.).

1. b Le génotype du diploïde peut s’écrire, pour les seuls gènes qui nous intéressent :

À l’issue de la méiose et des éventuelles recombinaisons génétiques (par crossing-over si liaison physique; par assortiment aléatoire des centromères si indépendance physique), quatre types de spores sont formés :

– Parentale (cyc1-76; pet+) de phénotype connu [gly+, lct–];

– Recombinée (cyc1-76; pet17) de phénotype a priori inconnu [gly ?, lct ?];

– Recombinée (cyc1+; pet+) de phénotype connu [gly+, lct+]; – Parentale (cyc1+; pet17) de phénotype connu [gly–, lct–].

Les 6 tétrades avec 2 [gly+, lct–] et 2 [gly–; lct–] sont des DP.

Les tétrades DR ou T contenant 4 ou 2 spores recombinées contiendront au moins 2 ou 1 spore(s) de phénotype [gly+, lct+].

De ce fait les DR devant contenir au moins deux spores recombinées de phénotype [gly+, lct+] sont donc les 5 tétrades avec 2 [gly+, lct+] et 2 [gly–; lct–], ce qui permet d’établir que la spore recombinée (cyc1-76; pet17) est de phénotype [gly–, lct–].

Ce résultat est logique puisque cette spore est dépourvue de cytochrome a/a3. Du point de vue cartographique, les fréquences des DP et des DR étant égales, on peut conclure que les gènes pet et cyc1 sont génétiquement indépendants.

Comme, par ailleurs, la fréquence des tétratypes (9/20) est inférieure à 2/3, on peut conclure que les gènes pet et cyc sont physiquement indépendants.

1. c Il suffit de prendre une spore de phénotype [gly–, lct–] issue d’un DR, puisque, dans ce cas, les deux spores sont du même génotype recombiné (cyc1-76, pet17).

En raison de l’épistasie de pet17 sur les allèles cyc1+ ou cyc1-76 pour le phénotype glycérol, il serait impossible de spécifier sans ambiguité (c’est-à-dire sans recourir à des études complémentaires) les génotypes, parental ou recombiné, des deux spores [gly–, lct–] issues d’un tétratype.

2. Le croisement des révertants R1 ou R3 par la souche D est, pour le gène cyc1, un croisement par sauvage, et constitue un test de classe du révertant. Le fait de retrouver des phénotypes [lct–] en nombre (ce ne peut être des mutants) prouve que la mutation originelle cyc1-76 n’a pas disparu et que son effet est supprimé, chez les deux révertants de seconde classe R1 et R3, par l’effet d’une mutation suppresseur.

Le génotype du diploïde peut s’écrire, pour les seuls gènes qui nous intéressent, où i est 1 ou 3, selon le révertant étudié :

À l’issue de la méiose et des éventuelles recombinaisons génétiques (par crossing-over ou assortiment aléatoire des centromères), quatre types de spores sont formés :

– Parentale (cyc1-76; sui a) de phénotype connu [lct+];

– Recombinée (cyc1-76; sui i) de phénotype connu [lct–];

– Recombinée (cyc1+; sui a) de phénotype a priori inconnu [lct ?];

– Parentale (cyc1+; sui i) de phénotype connu [lct+].

Les tétrades avec 4 [lct+] sont des DP (tabl. 7.8).

Les tétrades DR ou T contenant 4 ou 2 spores recombinées contiendront au moins 2 ou 1 spore(s) de phénotype [lct–].

De ce fait les DR devant contenir au moins deux spores recombinées de phénotype [lct–] sont donc les tétrades avec 2 [lct+] et 2 [lct–], ce qui permet d’établir que la spore recombinée (cyc1+; sui a) est de phénotype [lct+], résultat logiquement attendu. Du point de vue cartographique, les conclusions diffèrent pour chacune des deux mutations suppresseurs.

Pour su1, le suppresseur de R1, les fréquences des DP et des DR étant égales, on peut conclure que les mutations cyc1-76 du gène cyc1 et su1a sont génétiquement indépendantes.

Comme, par ailleurs, la fréquence des tétratypes (21/30) est égale à 2/3, on ne peut rien conclure quant à leur éventuelle indépendance physique.

Pour su3, le suppresseur de R3, la fréquence des DP étant très supérieure à celle des DR, on peut conclure que les mutations cyc1-76, du gène cyc1, et su3a sont génétiquement et donc physiquement liées.

Leur distance génétique, exprimée en fréquence de chromatides remaniées (plus précise que celle exprimée en fréquence de gamètes recombinés, mais estimable uniquement par analyse de tétrades) est égale à [3f(DR) + f(T)/2] × 100, soit 25 ur.

3. a La souche S est de génotype (cyc1-76, pet17, trp1-4, ade2-1).

Croisée avec chacun des révertants R1 ou R3 on obtient, pour les gènes impliqués dans le phénotype considéré, le génotype du diploïde (les pointillés indiquent d’éventuelles liaisons, mais on sait que pet est physiquement indépendant de cyc, que su1 est génétiquement indépendant de cyc, et que su3 lui est lié) :

À l’issue de la méiose et des éventuelles recombinaisons génétiques (par crossing-over ou assortiment aléatoire des centromères), quatre types de spores sont formés :

– Parentale (cyc1-76, sui i ; pet17) de phénotype connu [gly–, lct–];

– Recombinée (cyc1-76, sui i ; pet+) de phénotype connu [gly+, lct–]; – Recombinée (cyc1-76, sui a; pet17) de phénotype inconnu [gly ?, lct ?]; – Parentale (cyc1-76, sui a ; pet+) de phénotype connu [gly+, lct+].

Les tétrades avec 2 [gly+, lct+] et 2 [gly–; lct–] sont des DP (tabl. 7.9 : six dans le croisement de S avec R1 et sept dans le croisement de S avec R3).

Les tétrades DR ou T contenant 4 ou 2 spores recombinées contiendront au moins 2 ou 1 spore(s) de phénotype [gly+, lct–]. De ce fait les DR devant contenir au moins deux spores recombinées de phénotype [gly+, lct–] sont donc :

– les 7 tétrades avec 2 [gly+, lct–] et 2 [gly+; lct+], dans le premier croisement;

– les 8 tétrades avec 2 [gly+, lct–] et 2 [gly–; lct–], dans le deuxième croisement.

Ce résultat, but du croisement réalisé, permet d’établir le phénotype de la spore recombinée de génotype (cyc1-76, pet17, sui a), qui, pour une fois n’est absolument pas prédictible puisque tout dépend de la capacité éventuelle de la mutation suppresseur sui a de supprimer aussi bien l’effet de la mutation cyc1-76 que celui de la mutation pet17, ce qui dépend notamment de la nature de cette dernière.

Ce résultat permet une interprétation fonctionnelle de l’effet des suppresseurs et de celui de la mutation directe pet17.

• Croisement R1 × S La spore recombinée (cyc1-76; pet17, su1 a) est de phénotype [gly+, lct+], ce qui signifie que le suppresseur su1a corrige aussi l’effet de la mutation pet17 qui, sinon, serait épistatique sur tout effet fonctionnel sauvage au gène cyc1 (comme cela a été montré).

Il s’agit donc d’un suppresseur non gène-spécifique et allèle-spécifique :

– c’est un suppresseur informationnel de non-sens ambre puisque la mutation cyc1-76 est ambre;

– ce qui signifie que la mutation pet17 est également ambre.

• Croisement R2 × S La spore recombinée (cyc1-76; pet17, su3 a) est de phénotype [gly–, lct–], ce qui signifie que le suppresseur ne corrige pas l’effet de la mutation pet17, et ne peut lever l’effet d’épistasie sur la fonction de cyc1, alors que l’effet de la mutation cyc1-76 est supprimé par celui de su3 a.

Comme on sait (conclusion du croisement précédent) que les mutations cyc1-76 et pet17 sont ambres, le suppresseur su3 est sans doute un suppresseur physiologique… ou un suppresseur d’ambre qui apporte un acide aminé se révélant compatible dans la chaîne peptidique de l’iso1cytochrome c, alors qu’il ne le serait pas dans celle du cytochrome a/a3 !

Du point de vue cartographique, les fréquences des DP et des DR étant égales, on peut conclure que le gène pet et chacun des suppresseurs su1 et su3 sont génétiquement indépendants.

Comme, par ailleurs, les fréquences des tétratypes ne sont pas inférieures à 2/3, on ne peut rien conclure sur leurs éventuelles indépendances physiques.

3. b La souche S est de génotype (cyc1-76, pet17, trp1-4, ade2-1).

Croisée avec chacun des révertants R1 ou R3 on obtient, pour les gènes impliqués dans les phénotypes d’auxotrophie, le génotype du diploïde (où i est 1 ou 3, selon le croisement) :

À l’issue de la méiose et des éventuelles recombinaisons génétiques (par crossing-over ou assortiment aléatoire des centromères), quatre types de spores sont formés, pour les gènes trp1 et su :

– Parentale (trp1-4, sui i) de phénotype connu [trp–];

– Recombinée (trp1-4, sui a) de phénotype inconnu [trp ?];

– Recombinée (trp1+, sui i) de phénotype connu [trp+];

– Parentale (trp1+, sui a) de phénotype connu [trp+].

Le phénotype de la spore recombinée (trp1-4, sui a) dépendra de l’éventuel effet du suppresseur de cyc1-76 sur trp1-4.

• Si le suppresseur de cyc1-76 a un effet sur trp1-4, cette spore sera de phénotype [trp+] et on devrait observer, si la recombinaison le permet, des DR avec 4 spores [trp+].

C’est le cas parmi les treize tétrades issues du croisement R1 × S (tabl. 7.10), ce qui :

– confirme bien que su1a est un suppresseur non gène-spécifique mais allèle-spécifique, suppresseur informationnel d’ambre;

– permet de préciser que la mutation trp1-4 est, elle aussi, une mutation ambre;

– permet de préciser que les mutations his1 et met14 n’étaient pas ambres, sinon le révertant ne serait pas resté auxotrophe pour l’histidine et la méthionine… à moins que ce soit des mutations ambres qui ne seraient pas corrigées car le suppresseur apporterait un acide aminé non compatible pour la chaîne peptidique codée par le gène his1 et/ou le gène met14 !

• Si le suppresseur de cyc1-76 n’a pas d’effet sur trp1-4, cette spore sera de phénotype [trp–] et on devrait observer, quel que soit le type de tétrades, DP, DR ou T, des asques avec 2 spores [trp+] et 2 spores [trp–], correspondant à la seule ségrégation 2/2 du couple d’allèles trp1+/trp1-4.

C’est le cas parmi les tétrades issues du croisement R3 × S (tabl. 7.10), ce qui confirme bien que su3 n’est sans doute pas un suppresseur d’ambre (qui ne marcherait pas pour pet17) mais bien un suppresseur physiologique. Pour le confirmer il suffirait, ainsi, de montrer que le cytochrome c présent chez le révertant R3 n’est constitué que d’iso2cytochrome c.

L’analyse des tétrades pour l’auxotrophie à l’adénine (tabl. 7.11) montre que les suppresseurs su1 et su3 n’ont aucun effet sur la mutation ade2-1 qui n’est sans doute pas une mutation ambre (puisque pas d’effet de su1).

Du point de vue cartographique, parmi les trois types de tétrades du croisement R1 × S, pour le phénotype d’auxotrophie au tryptophane, les fréquences des DP et des DR étant égales, on peut conclure que la mutation trp1-4 et le suppresseur su1 sont génétiquement indépendants.

Comme, par ailleurs, la fréquence des tétratypes est inférieure à 2/3, on peut conclure qu’elles sont physiquement indépendantes.

On ne peut évidemment rien conclure pour ade2-1 puisque les différents types de tétrades ne peuvent être phénotypiquement distingués.

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