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Génétique
Analyse génétique des révertants et des suppresseurs
Cours de Génétique
 

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Exercice 7.3

La séquence de l’iso1-cytochrome c, dont la fonction est définie dans l’énoncé de l’exercice 7.4, a été obtenue par les protocoles classiques de la biochimie des protéines. Elle est la suivante :

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– position 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 – résidu met thr glu phe lys ala gly ser ala lys lys gly ala À partir du mutant cyc1-183 (différent de cyc1-76), dépourvu d’iso1-cytochrome c, on a obtenu indépendamment 56 révertants à partir desquels l’iso1-cytochrome c présent est extrait, purifié et analysé.

1. On trouve 22 types différents de chaînes révertantes, différant de la chaîne sauvage par un ou plusieurs acides aminés contigus.

Peut-on conclure que le gène touché chez le mutant est le gène de structure de l’iso1-cytochrome c ?

2. Peut-on définir la nature de la mutation touchant le gène cyc1 chez le mutant cyc1-183 ?

3. La séquence peptidique du révertant cyc1-183T a été établie et diffère de la séquence sauvage pour les 9 premiers acides aminés.

Elle est la suivante :

– position 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

– résidu met met asn ser arg pro val leu leu arg lys gly ala Vous établirez, pour les deux séquences peptidiques, SSR et révertante, les séquences nucléotidiques possibles, et préciserez la position, la nature et l’effet de la mutation directe chez cyc1-183, puis, si possible, la position, la nature et l’effet du suppresseur intragénique.

– Mise en évidence de la nature d’une mutation directe par l’analyse biochimique des révertants.

– Déduction d’une séquence nucléotidique par comparaison des séquences peptidiques sauvage et révertantes. NB : problème adapté du cours de C. Isnard, à partir des travaux de J. Verdière (CNRS/Gif s/Yvette).

Solution

1. Le gène cyc1 est bien le gène de structure de l’iso1-cytochrome c, car si le mutant cyc1-183 n’était pas touché dans le gène de structure mais dans un gène conditionnant l’expression du gène de structure, la séquence de celui-ci serait restée sauvage et la chaîne peptidique du révertant également.

On a 22 révertants différents parce que certains des 56 révertants sont identiques, bien qu’indépendants.

2. Le mutant cyc1-183 est un mutant de décalage du cadre de lecture, par délétion ou par insertion d’une paire de base, le révertant contient une deuxième mutation de décalage dont l’effet est suppresseur (elle recale le cadre) parce qu’elle est de nature opposée, insertion si la première est une délétion, ou réciproquement.

Entre les deux mutations le cadre reste décalé, ce qui entraîne une variation de séquence peptidique entre les chaînes sauvage et révertante.

D’un révertant à l’autre la distance entre les deux mutations n’est pas la même, et selon le nombre de codons inclus dans cette séquence décalée, les chaînes peptidiques sauvages et révertantes varient d’un nombre d’acides aminés différent.

3. La figure 7.4 présente les séquences nucléotidiques possibles des chaînes SSR et cyc1- 183T.

On voit bien que l’événement permettant d’obtenir un codon AUG (met) en position 1 chez le révertant est une délétion de la cytosine du codon 1 sauvage qui va conduire à un décalage du cadre de lecture et à la présence d’une autre séquence peptidique.

La comparaison entre les séquences nucléotiques possibles pour les neuf premiers acides aminés des chaînes SSR et cyc1-183T permet d’ailleurs d’identifier les codons sauvages qui, par décalage, vont pouvoir spécifier la séquence chez le révertant (voir plus loin).

• Chez le mutant cyc1-183 ce décalage se perpétue et conduit à une chaîne aberrante et avortée (un codon stop est toujours très vite généré par un décalage), entraînant la perte de fonction du gène.

• Chez le révertant cyc1-183T, une addition quelque part autour du codon 10 va recaler le cadre, mais laisser une séquence décalée entre les codons 1 et 9, entraînant la différence de séquence peptidique pour les 9 acides aminés de l’extrémité N-terminale de l’iso1 cytochrome c.

Connaissant les séquences peptidiques sauvages et révertantes, et le code génétique, il est possible de définir les différents codons possibles aux positions 1 à 12, puis d’identifier la séquence nucléotidique des 9 premiers codons, en identifiant lequel des codons signifiants sauvages est capable de donner, par décalage d’une paire de base vers la gauche, l’un des codons signifiants de la séquence peptidique révertante.

Ainsi, le G du codon 2 sauvage, devenant la troisième base du codon 1 chez le révertant, le codon 2 du révertant est obligatoirement constitué du doublet AA, puisqu’il spécifie une asn, ce qui permet de conclure que le codon 2 sauvage est GAA et non GAG.

De même le codon 3 sauvage est UUC et non UUU, puisque, par décalage, le codon 3 de la séquence révertante commence par le doublet UC, car il spécifie une sérine, et ainsi de suite…

La séquence des bases ainsi déduite est donnée par les lettres en gras; on a souligné la cytosine perdue dans le codon 1 du mutant cyc1-183.

• Séquences peptidique et nucléotidique possibles chez le sauvage

Figure 7.4 Séquences nucléotidiques des chaînes SSR et cyc1-183T

La mutation suppresseur est une addition d’une base recalant le cadre de lecture. Compte tenu des séquences nucléotidiques et peptidiques sauvage et révertantes, plusieurs solutions sont possibles :

– une addition d’une adénine A en première ou en deuxième position du codon 10 muté qui serait AGG, donnant alors AAG, et recalant la troisième base G dans le codon 11;

– une addition d’une guanine G en troisième position du codon 10 muté qui serait AAG, donnant alors AAG, et recalant la troisième base G dans le codon 11;

– une addition dans le codon 11 muté, ce qui implique alors que le codon 10 muté reste AAG (lys), et que le codon sauvage était AAA.

Dans ce cas, on peut imaginer l’addition d’une guanine G en position 1 ou 2 du codon muté 11, ce qui rétablit un codon glycine, ou une addition d’une guanine G en position 3 du codon 11, ce qui implique alors que le codon 11 muté était un codon GGG, afin que la base G recalée reconstitue un codon alanine;

– une addition dans le codon 12 muté, ce qui implique alors que le codon 10 muté reste AAG (lys), que le codon sauvage 11 était GGG pour que le codon muté demeure un codon GGN (gly).

Dans ce cas, on peut imaginer l’addition d’une guanine G en position 1 du codon 12, qui rétablit un codon alanine.

Exercice 7.4

Le mutant cyc1-13 est dépourvu d’iso1-cytochrome c, comme les mutants cyc1-76 et cyc1-183 (voir exercices précédents).

On obtient, à partir du mutant cyc1-13, une série de révertants de première classe, à partir desquels on extrait et on caractérise la chaîne peptidique d’iso1-cytochrome c :

– neuf révertants de cyc1-13 présentent une chaîne peptidique identique à la chaîne sauvage; – dix révertants de cyc1-13 présentent une chaîne plus courte que la chaîne sauvage de quatre acides aminés, à l’extrémité N-terminale;

– huit révertants de cyc1-13, présentent une chaîne plus longue que la chaîne sauvage à l’extrémité N-terminale, les quatre acides aminés en position 1-2-3-4 dans la chaîne sauvage, soit thr-glu-phe-lys (fig. 7.4), étant précédés par une isoleucine chez ces huit révertants.

On a isolé, en plus de cyc1-13, sept autres mutants directs, nommés m1 à m7, qui donnent eux aussi des révertants dont la chaîne peptidique est soit plus courte de quatre acides aminés, soit plus longue.

Chez les révertants dont la chaîne est plus longue, les quatre acides aminés thr-glu-phe-lys, correspondant aux acides aminés 1-2-3-4 de la chaîne sauvage, sont respectivement précédés par une isoleucine s’ils sont isolés des mutants m1 ou m2, par une leucine s’ils sont isolés des mutants m3, m4 ou m5, par une arginine, s’ils sont isolés de m6, et par une valine s’ils sont isolés de m7.

Interprétez ces résultats en définissant le site, la nature et l’effet de la mutation directe, le site, la nature et l’effet du suppresseur intragénique (aidez-vous de la séquence sauvage fig. 7.4 et du code génétique).

– Mise en évidence de la nature d’une mutation directe par l’analyse biochimique des révertants.

– Déduction d’une séquence nucléotidique par comparaison des séquences sauvage et révertantes. NB : problème adapté du cours de C. Isnard (Paris VI), à partir des travaux de J. Verdière (CNRS/Gif s/Yvette).

Solution. Le mutant cyc1-13 est muté au codon AUG (ou ATG) d’initiation de la lecture, le gène n’est plus fonctionnel car la traduction ne peut être initiée, faute d’un autre codon AUG en phase dans le voisinage immédiat.

Le révertant est un mutant qui présente un nouveau site AUG, en phase, dans le voisinage du site naturel, de telle sorte que la chaîne peptidique est fonctionnelle, ce qui conduit au phénotype sauvage chez ce révertant.

Quand la chaîne révertante est plus courte que la chaîne sauvage de quatre acides aminés, le site muté suppresseur est en 3′ du site naturel et correspond effectivement à la mutation du codon 4 AAG (lys) en un codon ATG (met).

Quand la chaîne révertante est plus longue que la chaîne sauvage de quatre acides aminés, le site muté suppresseur est en 5′ du site naturel, ce qui permet alors de spécifier la nature de la mutation directe affectant le codon AUG.

En effet, si les quatre acides aminés thr-glu-phe-lys correspondant aux acides aminés 1-2-3-4 de la chaîne sauvage sont précédés par une isoleucine, cela signifie que le codon AUG (met) d’initiation a été muté en un codon AUA ou AUC ou AUU spécifiant une isoleucine.

Les sept autres mutants du gène cyc1 sont également mutés dans le codon AUG d’initiation de la lecture comme le montre l’analyse des chaînes peptidiques révertantes.

La fréquence des mutants directs dans le codon AUG est cohérente avec le code génétique.

En effet, l’étude des révertants, avec une séquence allongée en 5′, montre que la mutation du codon AUG aboutit plus souvent à un codon isoleucine ou leucine qu’à un codon arginine ou valine (tabl. 7.7).

TABLEAU 7.7 ENSEMBLE DES CODONS FAUX-SENS POUVANT ÊTRE GÉNÉRÉS PAR LA SUBSTITUTION D’UNE PAIRE DE BASE DANS LE CODON AUG D’INITIATION DE LA LECTURE.

Aucun mutant direct du gène cyc sur le codon AUG donnant un codon ACG (thr) ou AAG (lys) n’a été obtenu, ce qui fait qu’on n’a obtenu aucun révertant présentant une thréonine ou une lysine en amont de la séquence thr-glu-phe-lys; à moins que de tels mutants soient survenus mais que, par hasard, les révertants obtenus présentaient une chaîne plus courte, ou bien qu’une thréonine ou une lysine soit incompatible avec une chaîne fonctionnelle…

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