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Génétique
Analyse génétique des révertants et des suppresseurs
Cours de Génétique
 

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Exercice 7.2

Chez Saccharomyces cerevisiae l’iso1-cytochrome c est codé par un gène nucléaire et occupe le cinquième rang dans la chaîne respiratoire, indifféremment avec l’isozyme iso2-cytochrome c. La chaîne peptidique de l’iso2 présente un grande homologie avec celle de l’iso1-cytochrome c; elle est également codée par un gène nucléaire.

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Dans les conditions normales (souche SSR) l’iso1-cytochrome c est présent dans 95 % des chaînes respiratoires tandis que l’iso2-cytochrome c n’est présent que dans les 5 % restants.

Plusieurs mutants d’un même gène, nommé cyc1, ont été isolés par des cribles sélectifs différents.

Ces mutants présentent tous une capacité d’absorption réduite, voire nulle, à la longueur d’onde de l’iso1-cytochrome c, et sont [lct–], incapables de pousser sur lactate, source de carbone non fermentescible, exigeant un métabolisme aérobie.

Cependant ils sont capables de pousser sur glycérol, un autre substrat exigeant un métabolisme aérobie car, avec 5 % de chaînes ayant incorporé de l’ios2, ils peuvent réoxyder suffisamment de donneurs d’électrons pour se développer.

1. À partir du mutant haploïde cyc1-76 (76e mutant du groupe cyc1) on prépare un extrait protéique qui est passé sur une colonne de résine échangeuse d’ions (amberlite CG50).

On n’observe aucune absorption spécifique de l’iso1-cytochrome c (défini par l’étude des cytochromes chez la SSR), mais on observe l’absorption spécifique correspondant à l’iso2-cytochrome c, en quantité égale à celle trouvée chez sauvage.

Ce résultat permet-il d’affirmer que le gène cyc-1 est le gène de structure de l’iso1- cytochrome c ?

2. À partir du mutant cyc1-76, on obtient une série de 21 révertants.

a. Dans 9 cas, le révertant croisé avec SSR, donne un diploïde dont la méiose fournit 3/4 de spores [lct+] et 1/4 de spores [lct–]. Dans 12 cas, le diploïde issu du croisement entre le révertant et la SSR donne des spores exclusivement [lct+]. Que déduisez-vous de ces résultats ?

b. Chez les 21 révertants l’absorption spécifique de l’iso1 est restaurée dans son volume d’élution spécifique après passage sur la colonne d’amberlite.

Ce résultat permet-il d’affirmer que le gène cyc1 est le gène de structure de l’iso1-cytochrome c ?

3. À partir de l’extrait protéique des 12 révertants précédents, nommés cyc1-76a à cyc1-76l, on purifie l’iso1-cytochrome c qu’on soumet à une digestion totale afin d’étudier sa composition en acides aminés (tabl. 7.6).

Ce résultat permet-il d’affirmer que le gène cyc1 est le gène de structure de l’iso1-cytochrome c ? Justifiez votre réponse et discutez de la nature de la mutation directe, en fonction de la diversité des propriétés biochimiques des différents acides aminés identifiés chez les révertants.

4. On réalise une digestion trypsique de l’iso1-cytochrome c purifiée chez les 12 révertants a à l, suivie d’une empreinte peptidique par électrophorèse- chromatographie bidimensionnelle.

a. Les cartes peptidiques de la SSR et des révertants b et g se superposent. Concluez.

b. Les cartes peptidiques des autres révertants ne se superposent pas à celles de la SSR pour un sous-peptide particulier dont on identifie la séquence primaire chez SSR et le révertant g :

Analysez ce résultat, en précisant la localisation du site muté, le codon sauvage, le codon muté et la mutation affectant le révertant.

TABLEAU 7.6 COMPOSITION TOTALE EN ACIDES AMINÉS DE L’ISO1 CYTOCHROME c EXTRAIT DE LA SOUCHE SAUVAGE OU DES 12 RÉVERTANTS DE PREMIÈRE CLASSE.

– Analyse de révertants, mise en évidence des suppresseurs.

– Analyse biochimique du produit chez les révertants, identification d’un gène de structure, identification d’un codon sauvage par analyse des substituants dans le produit chez les révertants.

NB : problème adapté d’un TD conçu par C. Isnard/J. Deutsch/D. Cohen (université Paris VI) à partir des travaux de J. Verdière (CNRS/Gif s/Yvette).

Solution

1. L’absence d’absorption à la longueur d’onde spécifique de l’iso1 dans tous les volumes d’élution prouve l’absence de cette protéine; il ne reste que l’iso2, chez le mutant cyc1-76.

Mais on ne peut pas en déduire que ce mutant est muté dans le gène de structure de l’iso1, car l’absence d’iso1 peut être autant due à une mutation dans son gène de structure que dans un autre gène en interaction avec lui, notamment un gène régulateur codant pour un répresseur ou un activateur du gène de structure.

2. a On a 9 révertants de seconde classe et 12 de première.

Chez les 9 révertants de seconde classe, le retour de spores [lct–] atteste que la mutation directe n’a pas disparu mais que son effet est supprimé par l’effet d’un suppresseur apparu par mutation chez le révertant.

Dans les 9 cas, ce suppresseur est génétiquement indépendant puisqu’on obtient 25 % de spores recombinées [lct–] de génotype (m–, sui); cette conclusion suppose cependant que les spores (m+, sua) sont a priori [lct+], ce qui serait logique mais n’est pas démontré.

Mais c’est probable car si leur phénotype était [lct–], il faudrait alors que la distance entre m et su soit précisément égale à 12,5 ur pour que la fréquence des spores recombinées soit égale à 25 % !

Dans les 12 autres cas, le fait de n’avoir pas mis en évidence de suppresseur indique qu’on peut avoir des révertants vrais, des révertants par mutation au site de la mutation directe ou des révertants porteurs d’un suppresseur très lié à la mutation directe, sans doute intragénique, mais pas obligatoirement.

2. b Dans tous les cas, la restauration de l’absorption prouve simplement que la protéine est présente car l’effet de la mutation touchant cyc1-76 est supprimé. Mais, pas plus que son absence chez le mutant (question précédente), cette restauration ne prouve pas que le gène cyc1, siège de la mutation directe de cyc1-76, est le gène de structure de l’iso1 plutôt qu’un autre gène…

3. Cette fois oui, on peut affirmer que le gène cyc1 est le gène de structure de l’iso1.

L’information apportée par l’étude biochimique ne concerne pas l’absence ou la présence de l’iso1, mais sa séquence en acides aminés, donc la séquence de son gène de structure.

Si cyc1-76 avait été muté dans un gène régulateur, la séquence du gène de structure serait restée sauvage et la séquence peptidique de l’iso1 serait restée sauvage chez tous les révertants.

On doit conclure que le mutant était porteur d’une mutation directe dans cyc1, le gène de structure de l’iso1, et qu’une nouvelle mutation dans ce gène lui permet, chez les 12 révertants, d’être exprimé en un produit fonctionnel mais légèrement différent du produit sauvage.

Chez tous les révertants, sauf un (cyc1-76/g), un glutamique (ou glutamine) a disparu au profit d’un autre acide aminé : il y a eu substitution par une lysine chez un; par une sérine chez un autre; par une leucine chez quatre; par une tyrosime chez un, et par un tryptophane chez quatre.

Il est donc vraisemblable que la mutation directe affectait un codon qui a été remplacé par un nouveau codon chez chacun des 12 révertants (réversion par mutation au site de la mutation directe).

Remarque. La mutation directe ne pouvait être un décalage de lecture car on n’imagine pas 12 révertants indépendants recalant la lecture au codon muté; en général, le recalage est légèrement en amont ou en aval, ce qui conduit à une différence peptidique de plusieurs acides aminés contigus dont la longueur est variable d’un révertant à l’autre.

La mutation directe était donc une mutation non-sens ou une mutation faux-sens affectant un codon du gène cyc1.

Il est peu vraisemblable que ce fut une mutation faux-sens. Dans une telle hypothèse, il faudrait considérer que l’acide aminé substituant conduisait, chez cyc1-76, à une iso1 instable ou inactive, or l’étude des 12 révertants montre, qu’au site de la mutation directe, il est possible de mettre n’importe quel substituant présentant des propriétés chimiques très différentes (sur le radical), hydrophobe (trp) ou ionisable (lys ou glu) ou polaire (ser).

Il est très vraisemblable que la mutation directe était un codon stop, remplacé, chez chaque révertant, par un codon différent, spécifiant un des cinq acides aminés substituants observés.

Le révertant cyc1-76/g peut être un révertant vrai ou non si le codon sauvage code pour glu et que le révertant possède glu ou gln (l’hydrolyse acide désamide la glutamine en glutamique).

4. a Les cartes peptidiques de la SSR et du révertant g se superposent, ce résultat serait logique si le révertant g était un révertant vrai, mais rev-g n’est pas obligatoirement un révertant vrai.

En effet, comme la carte peptidique du révertant b (qui possède un acide aminé substituant ser) se superpose également, le révertant g peut correspondre à une substitution glu/gln ou gln/glu.

4. b La comparaison des cartes montre que la mutation directe affecte un codon glu et que le révertant g, qui présente une gln, n’est pas un révertant vrai. Le codon sauvage est un codon glu, GAA ou GAG.

Si la mutation directe est (voir question précédente) une mutation stop, par substitution d’une paire de base, il s’agit du codon TAA si le codon sauvage est GAA, et du codon TAG si le codon sauvage est GAG.

CODE GÉNÉTIQUE STANDARD.

Pour savoir si le codon sauvage est GAA ou GAG, il faut s’aider du code génétique et voir, à partir des codons stop associés TAA et TAG, quels sont les révertants qui sont assez faciles ou assez difficiles à obtenir.

– Il est aussi facile d’avoir des révertants leucine à partir du codon stop TAA (les révertants auront TTA) qu’à partir du codon stop TAG (les révertants auront le codon TTG).

– Il est aussi facile d’avoir des révertants sérine à partir du codon stop TAA (les révertants auront TCA) qu’à partir du codon stop TAG (les révertants auront le codon TCG).

– Il est aussi facile d’avoir des révertants glutamine à partir du codon stop TAA (les révertants auront CAA) qu’à partir du codon stop TAG (les révertants auront le codon CAG).

– En revanche, il est aussi beaucoup plus difficile d’avoir des révertants tryptophane à partir du codon stop TAA (codon unique TGG), car il faut deux substitutions de paires de bases, qu’à partir du codon stop TAG où une seule substitution suffit.

Or, quatre des douze révertants présentent un codon révertant trp, ce qui prouve que celui-ci est facile à obtenir. On peut donc conclure que le codon sauvage est GAG et que la mutation stop directe est TAG.

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