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Pneumologie
Bactériologie de la tuberculose et des infections à mycobactéries atypiques (Suite)
Cours de pneumologie
 

 

* Critères culturaux et biochimiques :

Outre l’aspect caractéristique des colonies sur milieux à l’oeuf, on réalise classiquement trois tests principaux pour différencier M. tuberculosis des mycobactéries atypiques :

la production d’acide nicotinique ou niacine, la détermination de l’activité catalasique à 22 °C et à 68 °C (après chauffage pendant 20 minutes), et la sensibilité à l’acide para-amino-salicylique (PAS).

M. tuberculosis est niacine positif, catalase thermolabile (+ à 22° ; - à 68°) et sensible au PAS.

La catalase est thermostable pour la majorité des mycobactéries atypiques à l’exception de M. gastri, M. malmoense et M. haemophilum.

Au sein du complexe tuberculosis, la différenciation s’effectue d’une part sur l’aspect des colonies, sur les exigences nutritives, sur la production de niacine et la réduction des nitrates et, enfin, sur la sensibilité vis-à-vis de certains composés.

La classification de Runyon aide beaucoup à l’identification des mycobactéries atypiques qui, sur la base d’une vitesse de croissance et d’une pigmentation, sont simplement classées en quatre groupes.

L’aspect microscopique, l’aspect et le délai d’apparition des colonies sur milieu solide, les différentes activités enzymatiques permettront ensuite, au sein de chaque groupe, d’identifier spécifiquement chaque mycobactérie atypique.

Les méthodes d’identification biochimique sont souvent laborieuses, nécessitant des techniciens confirmés.

Il faut systématiquement une subculture, car une quantité importante de mycobactéries est nécessaire à la réalisation des tests enzymatiques.

Plusieurs milieux sont également ensemencés pour vérifier la température optimale de croissance, ou la production de pigment à l’obscurité ou en présence de lumière.

Tout ceci concourt à augmenter considérablement le délai de rendu du résultat final d’environ 3 à 6 semaines.

* Identification en milieu liquide :

Depuis quelques années, avec l’introduction des milieux liquides, un test rapide d’identification a été mis au point.

En effet, les méthodes biochimiques usuelles (niacine, catalase, PAS) ne sont pas appropriées pour les milieux liquides car elles nécessitent une subculture sur milieu solide.

Le test rapide en milieu liquide utilise la sensibilité des mycobactéries au p-nitro-á- acétylamino-bêta-hydroxypropiophénone (NAP).

Les mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis sont sensibles à ce composé, alors que les mycobactéries atypiques sont résistantes.

Ce test, réalisé sur des cultures liquides positives ayant un inoculum défini par l’index de croissance ou GI (100 < GI < 500), permet d’obtenir une identification en moins de 5 jours, et ce résultat est parfaitement corrélé aux méthodes classiques d’identification.

* Identification par une approche moléculaire :

+ Hybridation moléculaire :

Le test le plus couramment utilisé actuellement correspond au test Accuprobet (Gen-Probe) commercialisé par bioMérieux.

C’est un test d’identification rapide des mycobactéries (complexe M. tuberculosis, complexe M. avium, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae).

Il s’emploie à partir de cultures car sa sensibilité, limitée à 105-106 bactéries/mL, ne permet pas son utilisation directement sur les prélèvements cliniques.

Une sonde ADN, conjuguée à un marqueur chimioluminescent (ester d’acridinium), et complémentaire de l’ARN ribosomal 16S, est utilisée pour établir le diagnostic d’espèce.

Après séparation de l’ADN en simple brin, ceci est suivi d’une hybridation avec la sonde et une hydrolyse des ADN monocaténaires non hybridés.

Après ajout d’un substrat, un signal lumineux est détecté à l’aide d’un luminomètre.

La spécificité des sondes employées est supérieure à 95-99 %, et permet de rendre avec certitude un diagnostic d’espèce en un temps minimal de 2 heures.

Ces sondes peuvent être directement utilisées sur des cultures liquides positives, par exemple à partir de Bactec 12B, ou à partir de milieu 13A.

La sonde M. tuberculosis complex ne permet pas de différencier les espèces appartenant à ce complexe.

Des sondes spécifiques d’espèces permettent de différencier M. avium de M. intracellulare ce qui n’est jamais aisé par une approche biochimique ou par la sérotypie.

Une technique automatisée (système Vidas, bioMérieux), utilise une technique d’hybridation de l’ARN 16S à 37 °C sur une phase solide.

Le résultat est obtenu en 2 heures, et la réaction d’hybridation est entièrement automatisée, ne nécessitant que la préparation de l’échantillon.

+ Identification par amplification génique :

Le principe de l’utilisation de l’amplification génique pour une identification est basé sur le choix de cibles spécifiques, comme celles décrites dans le cadre du diagnostic rapide de M. tuberculosis (IS6110, ARN ou ADN 16S...), ou celles décrites pour les souches appartenant au complexe avium (pMAV22, DT6, DT1...) ou pour M. kansasii (MPTR, IS1652) mais cela limite le nombre d’espèces pouvant être identifiées par une même approche.

D’autres auteurs ont choisi d’associer à l’amplification, une restriction du produit amplifié.

Les enzymes de restriction ont la propriété de couper l’ADN en des points précis représentés par une séquence nucléotidique spécifique de l’enzyme.

En cas de modification de cette séquence, par mutation notamment lors de l’évolution respective de chaque espèce, l’enzyme ne coupe plus à l’endroit initial.

En choisissant des cibles précises comme le gène codant pour l’ARN 16S, ou le gène codant pour la protéine de choc thermique de 65 kDa, les auteurs ont défini des profils de restriction du produit d’amplification spécifique de chaque espèce.

Ceci simplifie considérablement le cheminement de l’identification, car l’amplification/restriction peut être réalisée directement à partir des colonies isolées sur milieu solide, ou bien à partir du milieu liquide positif, ce qui raccourcit considérablement les délais.

* Identification par chromatographie :

Comme nous l’expliquions précédemment, les esters d’acides mycoliques sont spécifiques d’espèces.

À partir d’une culture contenant 107 mycobactéries/mL, une identification après extraction des composés lipidiques peut être réalisée.

Plusieurs auteurs ont donc développé des techniques de chromatographie, soit en couche mince, soit chromatographie gazeuse, soit HPLC, pour permettre une identification rapide des mycobactéries.

Malheureusement, du fait du coût de l’appareillage, ces techniques sont réservées aux laboratoires de référence.

3- Conclusions :

L’avancée importante du diagnostic bactériologique des mycobactéries a été la mise au point et l’utilisation de milieux de culture liquides, ainsi que la gestion automatisée de la croissance dans ces milieux.

Comparativement aux milieux solides à l’oeuf, ces milieux liquides se sont avérés plus sensibles, 90 à 95 % pour le milieu 12B versus 70 à 80 % pour le milieu de Löwenstein-Jensen, notamment dans le cas d’échantillons ayant un examen microscopique négatif ou d’infections chroniques.

Ils se sont montrés également plus précoces dans l’obtention d’une croissance bactérienne avec des différences de délais comprises entre 2 et 3 semaines si l’on ajoute le délai concernant l’identification.

Comparativement au MGIT en lecture manuelle et au milieu 12B, dont les délais de positivité étaient de l’ordre de 9 à 10 jours pour M. tuberculosis, et de 12 à 14 jours pour les mycobactéries atypiques, le milieu de Löwenstein-Jensen ne devenait positif, quelle que soit la mycobactérie isolée, qu’en 20 à 22 jours.

Ces résultats ont été confirmés dans d’autres études comparant milieu solide à l’oeuf, milieu biphasique et milieu liquide où les délais respectifs de positivité étaient 24,2 ± 7,5 jours, 17,5 ± 6,4 jours et 14,3 ± 8,2 jours.

Les milieux solides ne sont pas pour autant abandonnés car ils doivent continuer à être associés à un milieu liquide pour l’ensemencement de tout prélèvement reçu.

En effet, la sensibilité de la culture est supérieure de 4 à 6 % lorsque l’on associe au milieu liquide, un milieu solide.

D - Antibiogramme :

De même que la mise en culture, l’isolement et l’identification de l’agent pathogène sont indispensables au diagnostic de certitude de tuberculose ou d’autre mycobactériose, l’antibiogramme est obligatoire, permettant de par ses résultats d’évaluer les chances de succès du traitement institué en général de manière probabiliste.

On distingue pour cette analyse trois indications principales :

– chez tout nouveau malade, n’ayant reçu aucun traitement ;

– chez les malades atteints et déjà traités depuis plus de 3 mois ;

– chez les malades faisant une rechute.

L’antibiogramme peut se réaliser soit sur milieu solide, soit sur milieu liquide.

Le choix des antibiotiques dépend de la mycobactérie isolée avec, notamment pour M. tuberculosis, la réalisation d’un antibiogramme de première intention concernant les antituberculeux majeurs (isoniazide, rifampicine, éthambutol et streptomycine).

En cas de rechute ou d’échec clinique à 3 mois, des antibiotiques dits de seconde intention seront testés.

Pour les mycobactéries atypiques, le choix reste plus empirique et un pool d’antibiotique est proposé selon la vitesse de croissance de ces mycobactéries.

En fonction de l’espèce isolée, l’antibiogramme pourra être réalisé soit par la méthode des proportions, soit par détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI), soit selon une approche moléculaire.

1- Méthode des proportions :

* Milieu solide :

Le principe de l’antibiogramme repose sur le fait qu’au sein de chaque population de M. tuberculosis « naïve », il existe une proportion de mutants résistants aux antibiotiques utilisés en thérapeutique (variant entre 1/106 ou 108 selon l’antibiotique).

L’antibiogramme prend en compte cette donnée et évalue donc la proportion de mutants résistants à un antibiotique donné pour la souche isolée.

La méthode recommandée est la méthode des proportions.

Des tubes de milieux solides contenant des concentrations croissantes ou une concentration critique d’antibiotique, et des tubes de milieux solides sans antibiotique sont ensemencés.

Plusieurs inoculums bactériens peuvent être réalisés.

Il faut tenir compte du fait que les concentrations critiques employées par antibiotique diffèrent selon la méthode employée.

En confrontant le nombre de colonies obtenues sur les tubes témoins et sur les tubes avec antibiotique, on détermine la proportion exacte de mutants résistants à l’antibiotique.

Sur la base des études cliniques et des études bactériologiques, une population dans laquelle le pourcentage de mutants résistants est supérieur à la proportion critique est considérée comme résistante.

À l’inverse, si ce pourcentage est inférieur, la population est dite sensible.

Cette information est essentielle pour l’interprétation de l’antibiogramme, car elle préjugera de l’efficacité thérapeutique.

Cette méthode peut être employée indirectement à l’issue d’un isolement, ou directement à partir d’un échantillon ayant un examen microscopique positif.

* Milieu liquide :

Le milieu de Youmans (Antibio test Mycobacterium,

Diagnostic Pasteur) ainsi que le milieu 12B (Bactec 460TB, Becton-Dickinson) sont utilisés.

La méthode en milieu 12B, mise au point par Middlebrook en 1977, utilise un principe identique à la méthode en milieu solide, mais plutôt que de dénombrer des colonies sur milieu solide, on évalue le dégagement de 14CO2, indirectement lié à un index de croissance, en présence ou en absence d’antibiotique à une concentration critique.

On ensemencera des flacons de milieu 12B avec antibiotique avec un inoculum 100 fois plus important que dans le flacon sans antibiotique qui joue le rôle de témoin de croissance ou témoin 1 %.

Une souche sera considérée comme sensible quand la croissance obtenue en présence d’antibiotique sera inférieure à celle observée pour le témoin 1 %.

Ce seuil de 1 % est utilisé pour les antituberculeux de première intention, mais il sera de 10 % pour les autres antibiotiques comme le pyrazinamide par exemple.

La méthode de l’antibiogramme radiométrique est corrélée à 90-98 % avec la méthode des proportions en milieu solide.

L’antibiotest est une adaptation de la méthode des proportions avec, pour la majorité des antibiotiques testés, le seuil de résistance fixé à une proportion critique de 2 %.

La lecture se fait par appréciation visuelle de la croissance, et l’interprétation est réalisée dès qu’une croissance apparaît dans le tube témoin 2 %.

L’utilisation d’un milieu liquide a considérablement simplifié cette détermination de la sensibilité et a, de fait, diminué de manière importante le délai de rendu de l’antibiogramme.

2- Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) :

Cette méthode peut être réalisée en milieu solide ou liquide selon les éléments décrits précédemment.

On déterminera la plus faible concentration d’antibiotique capable d’inhiber 99 % de l’inoculum.

La mise au point de fines bandelettes de plastique inerte (bandelettes E-Test, AB-Biodisk), imprégnées, sur la face inférieure, par un gradient exponentiel d’antibiotique, a facilité la détermination de la CMI pour les bactéries usuelles.

Le dépôt de cette bandelette sur un milieu gélosé établit directement un gradient de concentration au sein de la gélose.

Une ellipse d’inhibition est alors observée, et permet de rendre directement la CMI qui correspond au point d’intersection entre la bandelette et la zone d’inhibition.

Cette technique a été développée sur des milieux appropriés à la croissance des mycobactéries, permettant de rendre rapidement les CMI de plusieurs antibiotiques pour une mycobactérie donnée.

Il est important de bien suivre les recommandations du fabricant quant à l’utilisation de ces bandelettes.

L’une des difficultés est la standardisation de l’inoculum, pouvant être à l’origine de la détection de fausses résistances.

3- Détermination de la sensibilité aux antituberculeux par une approche moléculaire :

Ces techniques concernent exclusivement la détermination de la sensibilité de M. tuberculosis à certains antibiotiques antituberculeux, et sont développées pour répondre à certains problèmes graves de santé publique, notamment la détection rapide de souches de M. tuberculosis multirésistantes.

* Détection rapide de la résistance à la rifampicine (Innolipa Rif. TBt, Innogenetics, Bruxelles, Belgique) :

Lorsqu’une souche de M. tuberculosis est résistante à la rifampicine, elle a 95 % de chances d’être multirésistante, c’est-à-dire résistante aux deux antituberculeux majeurs que sont l’isoniazide et la rifampicine.

Cette technique utilise la connaissance des mécanismes de résistance à la rifampicine, détaillés ci-après.

Une région de l’ADN de M. tuberculosis, correspondant au gène rpoB est amplifiée par PCR.

Après dénaturation, l’ADN amplifié est hybridé avec dix oligonucléotides immobilisés sur une membrane de nitrocellulose.

Cinq des 10 oligonucléotides couvrent les sites les plus fréquents de mutations dans le gène rpoB.

Les autres confirment d’un côté l’identification de la souche étudiée, et de l’autre identifient la nature de la mutation.

* Détermination rapide de la sensibilité par PCR-SSCP (« single strand conformational polymorphism »-PCR) :

Le principe est la modification de la configuration de l’ADN issu de la souche étudiée, révélée par l’altération de sa mobilité électrophorétique sous forme d’un simple brin en gel de polyacrylamide non dénaturant, lorsqu’il y a une modification de sa séquence nucléotidique en comparaison avec l’ADN issu d’une souche de même espèce et de phénotype sensible.

Malgré un caractère fastidieux, cette méthode a démontré toute sa fiabilité au regard des différents travaux réalisés sur des isolats cliniques de M. tuberculosis.

Cette méthode est rapide car basée sur une technique d’amplification génique ne nécessitant pas une extraction d’ADN préalable et directement applicable sur des bactéries isolées et traitées par choc thermique, permettant d’obtenir un résultat en 24 à 48 heures.

Elle a été appliquée pour la détermination de la résistance de M. tuberculosis à la rifampicine, à l’isoniazide, à la streptomycine et aux fluoroquinolones.

Après amplification des régions des gènes-cibles de la rifampicine (rpoB), de l’isoniazide (katG, inhA), de la streptomycine (rpsL ou rrs) et des fluoroquinolones (gyrA), on a pu mettre en évidence des polymorphismes chez 97 % des souches résistantes à la rifampicine, chez 75 % des souches résistantes à l’isoniazide, chez environ 60 % des souches résistantes à la streptomycine et chez quelques souches résistantes à l’ofloxacine.

* Détection de la résistance à l’aide de phages reporter (« luciferase reporter phage ») :

Les mycobactéries viables, infectées par un phage portant le gène de la luciférase flux, émettent de la lumière en présence de luciférine et d’adénosine triphosphate (ATP).

Après infection de trois espèces mycobactériennes : M. smegmatis, M. bovis et M. tuberculosis, et de leurs mutants résistants correspondants, les auteurs ont montré que seules les souches résistantes émettaient de la lumière, indiquant une viabilité de ces bactéries en présence d’antibiotique.

La détection de la résistance pouvait donc s’effectuer en infectant les isolats cliniques de M. tuberculosis avec ces phages et en observant l’émission de lumière en présence d’antibiotique.

Il faut partir d’une culture riche au départ, et ensuite cultiver les mycobactéries en présence d’antibiotique.

Quelques heures sont nécessaires pour l’infection par le phage, puis l’ajout de luciférine et la détection de la lumière émise à l’aide d’un luminomètre.

Cette méthode nécessite néanmoins la manipulation de quantités importantes de bacilles supposés résistants, et il existe une variabilité du nombre de récepteurs pour le phage, selon les souches, rendant cette technique difficilement applicable en laboratoire de routine.

Cette méthode est actuellement utilisée en recherche pharmaceutique pour la mise en évidence de nouveaux composés actifs sur M. tuberculosis.

Diagnostic sérologique de la tuberculose :

La réponse humorale dans la tuberculose reste mal connue et surtout mal perçue, aussi bien dans le domaine physiopathologique que dans le domaine du diagnostic.

Les difficultés historiques quant au rôle protecteur des anticorps vis-à-vis de M. tuberculosis sont une conséquence de la complexité de la réponse humorale vis-à-vis des antigènes mycobactériens.

Il semble en fait que des anticorps responsables soit d’un effet protecteur, soit d’un effet délétère existent, comme l’ont montré les différentes études réalisées durant de nombreuses années.

Avec l’avènement des anticorps monoclonaux, de nouvelles études pourront être réalisées pour démontrer l’efficacité ou non des anticorps dirigés contre des antigènes mycobactériens définis.

Une meilleure compréhension du rôle de ces anticorps dans la physiopathologie de l’infection pourrait permettre de comprendre pourquoi certains individus font la maladie et d’autres non.

Dans le domaine diagnostique, la sérologie n’a pas démontré totalement toute son efficacité car les nombreuses études publiées, même récentes, ne montrent pas une sensibilité suffisante (de 22 à >= 85 %).

Par ailleurs, avec une hétérogénéité individuelle de la réponse humorale variable suivant les antigènes protéiques utilisés, la sensibilité de ces tests a toujours été plus faible pour les sujets co-infectés par le virus VIH, comparativement aux sujets non infectés.

Enfin, de nombreux déterminants antigéniques, notamment d’origine protéique, sont communs à d’autres mycobactéries, entraînant des réactions croisées.

L’utilisation récente d’antigènes glycolipidiques spécifiques du complexe tuberculosis, a potentiellement modifié l’opinion que l’on pouvait avoir sur le sérodiagnostic, en ayant une meilleure sensibilité (75-80 %) pour une spécificité supérieure à 95 %, et surtout une réponse anticorps détectable de manière similaire chez les sujets VIH positifs et les sujets VIH négatifs.

Le test développé au laboratoire et utilisant trois antigènes glycolipidiques montre une sensibilité supérieure ou égale à 75 % pour une spécificité voisine de 97 % tous sujets confondus VIH positifs et négatifs.

Si l’on associe ces résultats à ceux de l’examen microscopique, la sensibilité est supérieure à 85 %, ce qui n’a jamais été obtenu pour un test rapide dans le diagnostic de tuberculose.

L’avenir du sérodiagnostic dans la tuberculose est en fait basé sur l’utilisation de mélanges d’antigènes, notamment d’antigènes glycolipidiques dont on connaît maintenant bien la spécificité d’espèce.

Mécanismes de résistance des mycobactéries aux antibiotiques :

La résistance aux antituberculeux, étudiée avec les souches de référence ou avec les isolats cliniques, résulte clairement de mutations affectant les gènes codant pour les cibles des antibiotiques.

Ces résultats excluent la possibilité que cette multirésistance observée pour certains isolats provienne de l’acquisition nouvelle de plasmide ou transposon, dont on connaît les risques en termes de transmission et de diffusion.

Le mécanisme résulte en fait d’une sélection progressive, par étapes, par mutations successives, dans ces gènes cibles.

Les raisons potentielles, voire principales, sont une prescription inappropriée ou mal conduite des antituberculeux, une mauvaise compliance.

Le fait que la tuberculose multirésistante provienne d’une difficulté de traiter correctement et non de l’acquisition de nouveaux mécanismes est en soi plutôt rassurant, permettant d’insister sur la supervision du traitement (DOT ou directly observed treatment).

Devant ce problème, il est important de développer d’une part la détection précoce de ces souches, et cela explique l’intérêt des techniques développées, et d’autre part d’assurer la protection de sujets à risque comme les sujets VIH positifs.

La plus grande partie du travail réalisé pour caractériser les mécanismes d’action des antituberculeux a commencé par l’observation de leurs effets sur d’autres bactéries et ensuite par étendre cette interprétation aux mycobactéries.

Cela n’est possible qu’avec des antibiotiques ayant un spectre d’activité large, comme la rifampicine, les aminosides ou les fluoroquinolones.

La rifampicine agit en se liant à l’ARN polymérase, inhibant la transcription.

La résistance est due à des mutations ponctuelles du gène rpoB, codant pour la sous-unité bêta de l’enzyme.

Les mutations surviennent dans une région centrale du gène, recouvrant à peu près 27 codons, à la fois chez E. coli et M. tuberculosis.

Par comparaison, à la fois le mode d’action et la sensibilité exclusive de M. tuberculosis à l’isoniazide restent l’objet de controverses : de l’inhibition à la synthèse des acides mycoliques jusqu’à interférer dans le métabolisme du NAD.

Les complications sont survenues lorsqu’il fut découvert que les souches dépourvues de catalase-peroxydase, codée par le gène katG, étaient résistantes à l’isoniazide ; indiquant que cet antibiotique devait être métabolisé dans la cellule avant de se lier ou d’agir vis-à-vis de la cible.

Cette enzyme est indispensable pour activer in vivo l’isoniazide en un dérivé toxique, et son absence entraîne une résistance à haut niveau vis-à-vis de l’isoniazide.

Deux cibles potentielles ont été identifiées, InhA et le complexe InhB, dont les modifications par mutation confèrent une résistance à bas niveau à l’isoniazide. InhAest une enoyl-acyl carrier protein impliquée dans la synthèse des acides mycoliques.

Les mutations sont retrouvées dans une région régulatrice du gène inhA, entraînant une surexpression de l’enzyme.

Ce mécanisme confère une résistance croisée à l’éthionamide.

Le complexe InhB, composé des deux enzymes, AcpM et KasA, intervient également dans le métabolisme des acides mycoliques.

Une étude sur une série limitée de souches résistantes à l’isoniazide a mis en évidence des mutations dans le gène kasA.

Néanmoins, il reste encore près de 20 % des souches isoniazide résistantes pour lesquelles aucun mécanisme n’a été identifié.

La streptomycine interfère avec la synthèse protéique.

Elle induit une mauvaise lecture du code génétique et une inhibition de l’initiation de la traduction.

Des mutants spontanés ont été isolés dès le début de l’utilisation de cet antibiotique en monothérapie.

La résistance à la streptomycine intervient également par mutations ponctuelles pour la majorité des souches isolées.

Ces mutations interviennent soit sur le gène rpsL codant pour la protéine ribosomale S12, soit sur le gène rrs codant pour l’ARN 16S.

Sur 38 isolats cliniques de M. tuberculosis, 20 possèdent une mutation sur le gène rpsL, avec remplacement sur la protéine S12 d’une lysine par une arginine ou une thréonine en position 43 et 80 respectivement.

Parmi les 18 souches restantes, neuf présentent des mutations dans la région 513 ou 516 de la sousunité 16S.

Le pyrazinamide a une place spéciale dans le schéma thérapeutique de la tuberculose.

D’une part il est exclusivement actif sur M. tuberculosis, et d’autre part il semble agir sur une population semi-dormante de M. tuberculosis, non atteinte par les autres antituberculeux.

Il existe une différence entre M. tuberculosis et M. bovis : M. bovis est naturellement résistant au pyrazinamide et ne possède pas d’activité pyrazinamidase.

Chez M. tuberculosis, l’activité pyrazinamidase est en fait l’activité nicotinamidase, enzyme codée par le gène pncA et responsable du clivage du nicotinamide en acide nicotinique.

Les souches de M. tuberculosis résistantes au pyrazinamide ont perdu cette activité pyrazinamidase qui, par déduction, interviendrait dans l’activation in vivo du pyrazinamide comme cela est observé pour l’isoniazide.

Le gène pncA a été isolé de souches résistantes et les mutations ponctuelles sont observées, entraînant soit l’arrêt précoce de la transcription du gène, soit l’introduction d’erreurs dans la phase de lecture.

L’éthambutol est le seul antituberculeux de l’arsenal thérapeutique de première intention à avoir une activité bactériostatique.

Cette activité s’exprime au niveau de la synthèse de la paroi des mycobactéries.

Le mode d’action et les mécanismes de résistance sont de découverte récente.

La cible de l’éthambutol est l’enzyme arabinosyl-transférase, qui joue un rôle primordial dans la synthèse de l’arabinogalactane, composant majeur de la paroi des mycobactéries.

Les mutations sont retrouvées au niveau du gène embB, qui appartient à un opéron embCAB.

Il existe, comme pour l’isoniazide, plusieurs niveaux de résistance.

Les fluoroquinolones n’appartiennent pas aux antituberculeux de première intention, mais sont de plus en plus employées dans le cas de tuberculose résistante, ou dans certaines mycobactérioses à mycobactéries atypiques.

La sparfloxacine et l’ofloxacine semblent posséder la meilleure activité, suivie par la ciprofloxacine.

Le mécanisme de résistance est similaire à celui observé chez les bactéries usuelles.

La cible principale est l’ADN gyrase, topo-isomérase composée de deux sous-unitésAet B, codées respectivement par les gènes gyrA et gyrB.

La résistance à haut niveau est due principalement à des mutations autour du codon 90 de gyrA.

Les mutations sur gyrB, responsables d’un bas niveau de résistance, sont beaucoup plus rares.

La clarithromycine ainsi que l’azithromycine ne présentent pas d’activité sur M. tuberculosis, mais sont actives sur les mycobactéries atypiques, notamment M. avium et M. intracellulare ou M. kansasii.

Elles font partie des protocoles thérapeutiques pour le traitement des infections à M. avium complex, notamment chez les sujets co-infectés par le VIH.

Comparativement aux autres macrolides, la bonne activité de ces produits serait due à une meilleure diffusion intracellulaire et une meilleure affinité visà- vis des ribosomes de ces bactéries.

La prévalence de mutants résistants au sein d’une population naïve est comprise entre 10–7/10–8, démontrant qu’une sélection peut s’observer en cas de monothérapie si l’inoculum est supérieur à 108 bactéries.

Ceci a été démontré chez les sujets VIH positifs infectés par ces mycobactéries.

Le mécanisme de résistance démontré chez M. smegmatis est associé à une mutation ponctuelle du gène codant pour l’ARN 23S.

La faible perméabilité associée à des mécanismes d’inactivation ou d’efflux concourt à la résistance naturelle de M. tuberculosis à de nombreux antibiotiques.

Les résultats récents obtenus à partir de la séquence de M. tuberculosis montrent que de nombreux déterminants existent : enzymes inactivatrices comme les bêta-lactamases et des aminoglycoside-acétyltransférases, et des systèmes d’efflux comme de nombreux transporteurs ATP dépendants, ou des familles de protéines dites facilitatrices.

Approches moléculaires pour l’étude de l’épidémiologie de la tuberculose :

La lysotypie était, préalablement au développement de la biologie moléculaire, la technique de référence pour typer les différents isolats cliniques de M. tuberculosis.

La découverte de la séquence d’insertion IS6110, ainsi que la standardisation de la méthode de détection des polymorphismes de restriction de l’ADN de M. tuberculosis ou RFLP, en utilisant cette séquence comme sonde, a permis le développement des techniques de typage moléculaire des souches de M. tuberculosis.

La mise en évidence de marqueurs moléculaires similaires a permis le développement de ces techniques aux isolats cliniques de mycobactéries atypiques, notamment M. avium chez les sujets co-infectés par le VIH, ou M. kansasii.

Le développement majeur a été observé lors de la survenue d’épidémies de tuberculoses multirésistantes dans les pays développés, et pour lesquelles les mécanismes de transmission ont pu être expliqués grâce aux techniques de typage moléculaire.

La séquence IS6110 est utilisée comme un marqueur génétique de la variabilité des souches de M. tuberculosis.

Le nombre de copies sur le chromosome ainsi que leur localisation varient entre les souches, entraînant un niveau élevé de polymorphisme.

Le caractère discriminant est suffisant pour permettre d’affirmer que des souches sans relation épidémiologique possèdent des profils IS6110 différents, alors que des souches liées épidémiologiquement auront des profils IS6110 identiques.

Actuellement, cette méthode reste la méthode de référence malgré l’existence de plusieurs inconvénients, notamment la faisabilité et son pouvoir discriminant.

La technique est laborieuse, nécessitant une culture préalable suivie d’une extraction d’ADN jamais aisée avec les mycobactéries, d’une restriction, d’une migration sur gel d’agarose et enfin d’un southern blot.

L’utilisation en routine est donc difficile, voire impossible, et les souches ne seront testées qu’en grande série.

La détection de souches identiques est donc le plus souvent rétrospective et, de ce fait, de peu d’aide dans la gestion immédiate des sujets infectés.

D’autre part, le séquençage du génome de M. tuberculosis souche H37Rv a montré que la distribution des copies d’IS6110 n’était pas aléatoire, car ces copies étaient retrouvées sur une même partie du chromosome, de part et d’autre d’une région particulière appelée DR (direct repeat).

Ce pouvoir discriminant limité a été montré dans plusieurs études, rapportant des patients apparemment sans lien épidémiologique avec des profils IS6110 identiques.

Ces limitations ont imposé un besoin pour d’autres marqueurs génotypiques, d’autant plus que des souches avec un nombre faible, voire sans copies IS6110, ont été décrites.

Les autres méthodes utilisent des marqueurs identifiés chez M. tuberculosis : IS1081, MPTR (major polymorphic tandem repeat), une séquence riche en GC appelée PGRS (polymorphic GC rich repetitive séquence), et une région de 49 répétitions directes de 36 bp séparées par des séquences variables de 35 à 41 bp appelée DR. IS1081 et MPTR ne sont pas suffisamment polymorphiques chez M. tuberculosis, comparativement aux PGRS et DR qui représentent des outils épidémiologiques intéressants.

La détection du polymorphisme des séquences situées entre les éléments répétés identiques, ou DR, est appelée spoligotyping.

Elle est basée sur l’amplification génique d’un fragment d’ADN de M. tuberculosis dont la composition en séquences répétées varie de souche à souche.

Après hybridation selon la technique du dot-blot, sur des membranes prépréparées et commercialisées (Isogen BioScience BV, Maarsen, Hollande), un profil spécifique de souches est obtenu.

Cette technique peut être réalisée directement à partir de colonies isolées sur milieu solide ou de cultures liquides positives, et un résultat est obtenu en 48 heures.

Le caractère discriminant semble moindre que la technique IS6110, essentiellement pour les souches ayant plus de cinq copies d’IS6110, mais sa rapidité et sa praticabilité en font une très bonne technique pour réaliser un premier criblage.

Les souches de M. tuberculosis ayant un spoligotype différent auront toujours un profil IS6110 différent mais, en revanche, des spoligotypes identiques devront toujours être confirmés par la technique RFLP-IS6110.

C’est cette stratégie que nous utilisons actuellement au laboratoire, comme outil de contrôle de qualité dans la détection des contaminations croisées interéchantillons, permettant de rendre au clinicien un résultat positif en toute confiance. Une autre méthode rapide, dite LMPCR (ligation-mediated-PCR), repose sur l’amplification génique de séquences flanquantes de l’IS6110.

Cette technique repose sur le polymorphisme généré entre une séquence IS6110 et un site de coupure d’une enzyme de restriction (SalI).

Elle permet également de travailler directement à partir des cultures positives, et le résultat est visualisable sur gel d’agarose, sans passer par une étape d’hybridation supplémentaire.

Son caractère discrimant est intermédiaire entre le spoligotyping et la RFLP-IS6110, plus performante que le spoligotyping, en regroupant moins de souches avec un profil similaire.

Les applications principales des techniques de typage moléculaire ont pour but de détecter des épidémies et d’établir la transmission de souches sensibles ou résistantes de M. tuberculosis, de distinguer entre réinfection et rechute, de déterminer une origine nosocomiale d’une épidémie et enfin de révéler l’existence de contaminations interéchantillons, survenant soit lors de la réalisation des prélèvements, soit lors de leur traitement au laboratoire.

Les épidémies de tuberculose à bacilles multirésistants ont démontré toute l’efficacité des techniques de typage moléculaire.

Mais si la détection de la transmission nosocomiale des bacilles multirésistants de par leur phénotype de résistance est aisée, il n’en est pas de même pour les épidémies de tuberculose à bacilles sensibles.

L’épidémie survenue au centre hospitalier universitaire de Poitiers en 1992 a montré le pouvoir de ces techniques en révélant l’identité des souches isolées chez les membres du personnel hospitalier, et a relié cette épidémie à deux cas diagnostiqués chez deux patients hospitalisés dans ce service.

Elles ont permis également de différencier cette épidémie nosocomiale d’une épidémie communautaire de 15 cas, dans l’entourage d’un patient hospitalisé dans le service à la même époque.

Les autres applications concernent essentiellement la mise en évidence de contaminations survenant soit lors de la réalisation du prélèvement (bronchoscopes contaminés), soit lors du traitement de ces échantillons au laboratoire.

L’avancée majeure quant à l’utilisation de ces techniques, réside dans l’utilisation de l’amplification génique, permettant de confirmer avec certitude un résultat positif au clinicien en 48 heures en cas de doute.

Un dialogue entre bactériologiste et clinicien est indispensable pour éliminer ces résultats faussement positifs, dont les conséquences sociales sont importantes.

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