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Pneumologie
Biologie moléculaire : méthodes et applications aux maladies respiratoires
Cours de pneumologie
 

 

Apport des nouvelles technologies : puces à ADN en cancérologie pulmonaire :

Introduction :

Si le cancer à petites cellules (CPC) constitue une entité ayant ses caractéristiques propres, il n’en est pas de même pour les carcinomes non à petites cellules (CNPC) pour lesquels une nouvelle classification histopathologique a proposé un découpage en plus de 25 catégories dont on ne peut, pour l’instant, évaluer l’aide dans la prise en charge thérapeutique.

D’autres approches associant de nouveaux critères découlant des progrès de la biologie moléculaire sont en cours d’évaluation sous l’appellation de « carte génétique des tumeurs » ou de « dissection moléculaire des tumeurs ».

Cette taxinomie moléculaire est en cours de développement à partir de l’évaluation de l’expression concomitante d’un très grand nombre de gènes, ou étude du transcriptome.

Avant l’utilisation de tels outils, différentes tentatives de classification moléculaire ont été entreprises.

Ainsi, parmi les adénocarcinomes, plusieurs approches ont concerné les gènes de la p53 ou de ras ainsi que les anomalies chromosomiques.

Selon Koga et al, la présence d’ une mutation localisée entre les exons 2 et 9 du gène de la p53 est variable selon le sous-type histologique du bronchioloalvéolaire : absente des non invasifs, sa fréquence a été de 11 à 53 % dans les autres sous-types.

De même, dans les bronchioloalvéolaires inférieurs à 2 cm, Aoyagi et al ont retrouvé une perte allélique de huit loci, avec une fréquence d’autant plus importante que le grade histopronostique était élevé.

Ainsi, les pertes concernant 5q, 9p, 11q et 13q ont été retrouvées dans tous les groupes alors que les pertes pour 2p, 17q, 18q et 22q n’existaient que dans le groupe le plus péjoratif.

Ces pertes alléliques seules ne permettent donc pas d’isoler différents sous-types mais sont plutôt liées au caractère évolutif.

De ce fait, d’autres approches plus exhaustives se sont révélées nécessaires.

Technologie des puces à acide désoxyribonucléique (ADN) :

Les « puces à ADN » appartiennent à la technologie des microarrays (microréseaux) (DNA arrays, DNA chips, biochips, genechips, biopuces, ou « puces à ADN »), exploitant l’hybridation préférentielle de séquences simple brin d’acides nucléiques complémentaires (ADNc) : un échantillon de contenu inconnu est hybridé à une matrice recouverte, dans un ordre déterminé, de molécule d’ADN dont la séquence est connue ou d’oligonucléotides.

A - PUCES À ADNc :

Pour les puces à ADNc, des ADNc sont soit sélectionnés au sein de banques de séquences, appelées expressed sequence tag (EST : séquence partielle d’ADNc d’environ quelques centaines de nucléotides, suffisante pour identifier une séquence entière d’ADNc), soit générés à partir de tissus préalablement choisis.

Ces séquences sont amplifiées par polymerase chain reaction (PCR) et fixées sur une lame de petite taille (verre ou Nylon) avec une grande densité : 1 000 spots/cm².

B - PUCES À OLIGONUCLÉOTIDES :

Pour les puces à oligonucléotides, les plus récentes, des oligonucléotides de 25 à 60 mers (mers : nombre de nucléotides) sont directement synthétisés sur le support (verre ou silicium), leur nombre pouvant être supérieur à 10 000 spots/cm² (voire jusqu’à 250 000 dans certains prototypes).

C - TRAITEMENT DES PUCES ET COLLECTE DES RÉSULTATS :

Dans les deux cas, les puces sont hybridées avec les acides ribonucléiques messagers (ARNm) extraits des tissus, après rétrotranscription en ADNc lesquels vont être marqués par un fluorochrome ou un radionucléide.

L’intensité des signaux recueillis à l’aide d’un capteur approprié au mode de révélation est proportionnelle à l’intensité de fixation de l’ADNc.

Cette intensité est évaluée pour chaque séquence par rapport à un étalon servant aussi à effectuer des comparaisons entre différents échantillons pour un même support.

D - ANALYSE DES RÉSULTATS :

Ces puces fournissent dans un même temps des résultats pour un très grand nombre de gènes dont l’interprétation nécessite une gestion informatique appropriée, établissant ainsi une classification comparative des échantillons en fonction des ARNm présents.

1- Méthode de classification hiérarchique non supervisée :

Cette approche est une classification hiérarchique « non supervisée » regroupant les échantillons selon les profils d’expression des gènes les plus proches, ces profils étant regroupés puis reliés à d’autres selon leur degré de similitude, formant ainsi un dendrogramme en fonction des parentés transcriptionnelles.

Un des outils informatiques les plus utilisés, pour cette méthode, est le logiciel « Cluster » développé par Eisen.

2- Méthode supervisée :

La seconde approche est de comparer les profils d’expression selon une « méthode supervisée », c’est-à-dire à partir de critères préalablement définis en utilisant un groupe d’échantillons de calibrage ou training set réparti en N classes servant à établir et évaluer le regroupement de gènes dont l’expression peut être considérée comme « prédicteur ».

Une des méthodes les plus employées est celle du « plus proche voisin » (nearest neighbor classifier), sachant qu’à chaque échantillon est attribué une position dans un espace à K dimensions, K : nombre de gènes considérés, en fonction de l’expression pour ces gènes.

La distance entre les échantillons dans l’espace à K dimensions défini précédemment sert à identifier les plus proches voisins. Le nombre de gènes nécessaires à la classification est choisi parmi les plus discriminants au sein des sous-groupes.

Premiers résultats obtenus dans les carcinomes pulmonaires :

A - RÉSULTATS ANALYSÉS PAR LA MÉTHODE NON SUPERVISÉE :

Certains auteurs ont d’abord tenté de regrouper différentes tumeurs selon la méthode « non supervisée ».

Garber et al ont étudié le profil d’expression de tumeurs pulmonaires de patients ayant un suivi de 5 ans en utilisant une puce de 23 100 ADNc correspondant à 17 108 gènes établie avec les ARN provenant d’un panel de lignées cellulaires.

De ces ADNc, 918 seulement ont été retenus, représentant 835 gènes dont l’expression est la plus discriminante mettant en évidence une diversité au sein des adénocarcinomes contrairement aux carcinomes épidermoïdes et carcinomes à petites cellules beaucoup plus homogènes.

1- Carcinomes à grandes cellules :

Dans cette étude, les carcinomes à grandes cellules ont une forte expression d’un groupe de gènes incluant par exemple HMGI(Y), FOS-related antigen 1 et l’activateur tissulaire du plasminogène.

En revanche, ces tumeurs ont un faible niveau d’expression des molécules d’adhérence épithéliale et des gènes hautement exprimés dans les cellules épithéliales, suggérant un phénotype de transition épithéliomésenchymateux.

2- Carcinomes à petites cellules et carcinomes épidermoïdes :

Pour les carcinomes à petites cellules, l’expression de gènes correspondant à une différenciation neuroendocrine a bien été retrouvée. Les carcinomes épidermoïdes montrent, eux, des caractéristiques d’épithéliums épidermoïdes comme l’expression des cytokératines 5, 13 et 1.

Cette approche moléculaire n’a pas permis d’isoler de sous-groupes parmi les carcinomes à petites cellules, les carcinomes à grandes cellules et les carcinomes épidermoïdes.

3- Adénocarcinomes :

Il n’en est pas de même des adénocarcinomes parmi lesquels trois groupes différents ont pu être distingués selon leurs profils d’expression : deux exprimant un ensemble de gènes impliqués dans le métabolisme du surfactant dont TTF1, le troisième exprimant des gènes impliqués dans le remodelage tissulaire et l’angiogenèse.

Cette première étude a également montré, dans le groupe des adénocarcinomes, une possibilité de sous-typage moléculaire avec une dissociation entre les critères reconnus comme classiquement péjoratifs, en particulier morphologiques, et ceux retenus par l’analyse des patrons d’expression de groupes de gènes.

B - RÉSULTATS AVEC LA CLASSIFICATION HIÉRARCHIQUE SELON LES SÉQUENCES LES PLUS EXPRIMÉES :

Dans une autre étude, de Bhattacharjee et al, une classification hiérarchique des échantillons de différents types de carcinomes non à petites cellules reposant sur les 3 312 séquences les plus exprimées a été établie grâce à une puce à oligonucléotides.

1- Carcinomes à petites cellules et tumeurs carcinoïdes :

Dans les carcinomes à petites cellules et les tumeurs carcinoïdes, des gènes neuroendocrines sont retrouvés fortement exprimés et pour les cancers à petites cellules, d’autres gènes en plus tel que le gène de la thymosin-b ou de l’inhibiteur du cycle cellulaire C18-ink7.

2- Carcinomes épidermoïdes :

Dans les carcinomes épidermoïdes, sont retrouvés des marqueurs de kératinisation ainsi qu’une surexpresion de p63 et p53.

3- Adénocarcinomes :

Une évaluation isolée des adénocarcinomes et de tissus non tumoraux, en prenant en compte les 675 transcrits les plus exprimés, a abouti à la subdivision des adénocarcinomes en quatre sousgroupes, C1 à C4.

Le groupe C2 est caractérisé par la présence de marqueurs neuroendocrines.

Dans le groupe C3, il existe une coexistence d’expression de gènes exprimés dans le groupe C2 (par exemple l’ornithine decarboxylase 1, la glutathion transferase…) et de gènes exprimés par les pneumocytes de type II, également retrouvés dans le groupe C4 (TTF-1, gènes des protéines du surfactant B, D et C).

Le groupe C4, en plus de ces gènes exprimés dans les pneumocytes de type II, coexprime d’autres gènes tels que le cytochrome B5, la cathepsine H et MUC 1.

En plus de l’orientation vers des mécanismes biologiques propres à ces différents sous-types tumoraux, à ces « sous-groupes moléculaires » sont associées des caractéristiques, soit histomorphologiques, telles qu’un degré d’indifférenciation dans le groupe C1 à l’inverse de C2 ou C3, soit pronostique, la survie observée étant plus longue dans le groupe C2 et à l’inverse plus péjorative dans le groupe C1.

Il est donc possible de concevoir, à partir de cette étude, la réalisation d’un modèle simplifié par rapport aux puces actuelles applicable en clinique, reprenant le travail original, et regroupant sur une membrane les principaux gènes marqueurs de chaque sous-groupe.

C - IDENTIFICATION D’UN PROFIL DES ADÉNOCARCINOMES PRIMITIFS ET SECONDAIRES :

Une autre question abordée par la technologie des puces est l’identification d’un profil caractéristique des adénocarcinomes primitifs pulmonaires par rapport aux adénocarcinomes d’autres localisations.

1- Identification de marqueurs :

Ainsi, Giordano et al ont comparé les profils génétiques d’adénocarcinomes primitifs du côlon, de l’ovaire et du poumon, en utilisant une puce à oligonucléotides de 7 129 sets d’amorces pour 6 800 gènes provenant d’une banque d’EST.

Différents marqueurs ont été identifiés pour chaque groupe tumoral en utilisant les gènes qui ont la plus grande expression dans un type comparativement aux deux autres ; ainsi, les résultats obtenus en utilisant les profils des transcrits ont été meilleurs que ceux obtenus par la méthode conventionnelle d’immunohistochimie.

2- Profil établi par classification supervisée :

L’autre approche dans ce domaine est la « classification supervisée », utilisée par Su et al déterminant le profil d’adénocarcinomes de 11 origines différentes, soit 100 tumeurs différentes. D’une puce à oligonucléotide correspondant à 12 523 gènes n’ont été gardés que les 9 198 gènes ayant une intensité d’hybridation maximale.

Pour chaque classe de tumeurs, les dix gènes les plus discriminants ont pu être identifiés.

Pour certaines tumeurs, comme le poumon, l’identification est plus difficile du fait de l’absence de marqueurs hautement spécifiques.

La classification ainsi établie utilise 110 gènes préalablement déterminés.

En appliquant cette classification à 75 échantillons, l’origine de 85 % des tumeurs a pu être déterminée, incluant dans ces échantillons des métastases d’adénocarcinomes.

3- Difficultés :

La plupart des gènes identifiés utilisés comme marqueurs sont exprimés spécifiquement dans les épithéliums dont proviennent ces adénocarcinomes ; cependant, il existe des difficultés dans cette étude concernant les adénocarcinomes pulmonaires, car si parmi les marqueurs « spécifiques » d’adénocarcinomes pulmonaires, l’expression de gènes comme TTF-1 est bien retrouvée, en revanche, d’autres marqueurs appartiennent aux cellules stromales, en particulier inflammatoires tels que les lymphocytes T et B, les macrophages ou les polynucléaires neutrophiles, cellules ubiquitaires non spécifiques d’une tumeur donnée.

Cette étude montre la difficulté de classer des tumeurs pour lesquelles manquent des marqueurs génétiques spécifiques, ce qui est le cas des adénocarcinomes pulmonaires.

Néanmoins, il faut espérer que l’analyse de l’intégralité des transcrits humains permettra d’identifier des gènes plus spécifiques de ces tumeurs.

Cette approche rejoint celle de Ramaswamy et al dans laquelle un essai de typage moléculaire de différents types de cancers a été effectué en utilisant le screening de l’expression de 4 030 gènes grâce à une puce à oligonucléotides contenant 16 063 amorces.

Cette étude, analysant 218 échantillons tumoraux provenant de 14 types différents de cancer et 90 échantillons sains, montre que si pour certaines tumeurs (lymphomes, leucémies, tumeurs du système nerveux central) des regroupements caractéristiques peuvent être obtenus, en revanche, pour d’autres tumeurs, la classification moléculaire ne reconnaît pour l’instant que de l’ordre de 80 % des types tumoraux.

Il s’agit de résultats préliminaires qui ont le mérite de mettre en évidence des marqueurs non seulement déjà identifiés mais d’autres non suspectés.

De ce fait, le panel de gènes testés devenant plus important, l’outil va s’affiner rapidement permettant une identification moléculaire des différents types tumoraux.

Par ailleurs, dans cette étude, les tumeurs les moins différenciées n’ont pas pu être classées en fonction de leur tissu d’origine, ce qui peut laisser penser que ces tumeurs dérivent d’une population cellulaire distincte avec une évolution propre.

Autres méthodes d’étude de l’expression des gènes :

A - TECHNIQUE « SERIAL ANALYSIS OF GENE EXPRESSION » : SAGE

À côté de l’utilisation des puces pour l’étude du transcriptome, il existe d’autres méthodes et en particulier la technique SAGE qui permet d’obtenir de courtes séquences de nucléotides (une dizaine environ) pour chaque gène qui suffisent à son identification.

Ainsi, Natch et al ont étudié des carcinomes non à petites cellules, ainsi que des lignées de cellules des petites voies aériennes (SAEC : small airways epithelial cells), de cellules bronchiques (NHBE : normal human bronchial cells) et une lignée d’adénocarcinomes pulmonaires (A549) générant 374 634 séquences représentant 66 502 transcrits.

À partir de ces données, un classement hiérarchique à partir des 3 921 séquences SAGE apparaissant au moins dix fois dans chacune des librairies générées, sépare deux groupes, l’un contenant les lignées épithéliales SAEC et NHBE et l’autre associant la lignée A549, les adénocarcinomes et les carcinomes épidermoïdes.

Dès lors, en prenant en compte la différence d’expression des gènes entre les librairies, 58 gènes différencient les adénocarcinomes des SAEC et 71 gènes différencient les carcinomes épidermoïdes des NHBE.

Ces 115 gènes se répartissent en trois groupes : ceux présents dans les carcinomes épidermoïdes en rapport avec une activité de détoxification et antioxydante, ceux retrouvés dans les adénocarcinomes en rapport avec le codage de protéines des petites voies aériennes et des réactions immunologiques, enfin le dernier groupe regroupant des gènes associés à une différenciation épithéliale et sous-exprimés dans les adénocarcinomes.

Cependant, si l’intérêt est ciblé vers les gènes ayant un rôle dans les carcinomes non à petites cellules en comparant avec les tissus normaux, et non plus dans le but de différencier uniquement les types cellulaires, un nombre beaucoup plus important de gènes sont identifiés : 827 séquences séparent les carcinomes épidermoïdes et les NHBE dont dix séquences avec une expression différentielle supérieure à dix, de même 298 séquences séparent les adénocarcinomes des SAEC (20 séquences étant dix fois plus exprimées).

Cette approche montre donc l’importance des renseignements pouvant être obtenus concernant la cancérogenèse et la biologie tumorale en comparaison avec les tissus normaux.

B - ÉTUDE DU PROTÉOME (OU PROTÉOMIQUE) :

L’étude du protéome est l’étude de l’ensemble des protéines exprimées par une cellule ou un tissu à un instant donné.

Oh et al ont élaboré un projet d’étude global d’analyse moléculaire du cancer pulmonaire intégrant les caractéristiques cliniques et morphologiques de chaque échantillon avec les données de l’étude du protéome (gel 2D et spectrométrie de masse), du transcriptome (utilisation de puces à oligonucléotides) et de l’étude du génome par des enzymes de restriction.

Ils individualisent, comme étant discriminantes, pour les carcinomes à petites cellules, des protéines associées à la prolifération cellulaire (proliferating cell nuclear antigen : PCNA et oncoprotein 18 : OP18) ; alors que pour les épidermoïdes et adénocarcinomes, ils retrouvent plutôt une grande quantité de protéines S100 ainsi que la 27 kDa heat shock protein sous sa forme phosphorylée ou non.

Pour identifier de nouveaux marqueurs tumoraux, les auteurs recherchent également les protéines induisant une réponse anticorps détectable dans le sérum des patients ayant un cancer pulmonaire.

Conclusion :

Il est encore trop tôt pour conclure sur une liste de paramètres fixant une carte d’identité moléculaire pour chaque sous-type de cancer bronchopulmonaire.

Cependant, les progrès sont rapides dans ce domaine et on peut prévoir très prochainement la mise en évidence de molécules non seulement diagnostiques ou pronostiques mais également permettant de prédire de la réponse aux traitements, en particulier de chimiothérapie.

C’est dans ce dernier domaine que l’on peut attendre les avancées les plus prometteuses, en particulier dans le choix des agents cytotoxiques, résumé sous l’appellation de « chimiothérapie à la carte ».

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